写在前面的话 膜蛋白结构动力学 张凯
2 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. 膜蛋白结构动力学 张凯，中国科学院大学，生命科学学院，生物物理教研室 （
X.C.Zhang1,2*） 1NationalLaboratoryofBiomacromolecules,CASCenterforExcellenceinBiomacromolecules,InstituteofBiophysics,ChineseAcademyofSciences, 15DatunRoad,Beijing,China1001012CollegeofLifeScience,UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing, China100049*E-mailaddress：zhangc@ 封面释义：沙钟里飘落的尘砾代表着远比钻石还珍贵的时间。
©XCZ2019，2020，2021
3 写在前面的话 内容简介膜蛋白在生命细胞中扮演着多种重要的角色，与分子生物学、医药、农业、生物技术等领域密切相关。
针对膜蛋白的结构-功能研究是结构生物学中最活跃的前沿领域之
一。
本书从化学动力学角度探讨膜蛋白结构与功能的关系问题，对生物膜膜电位的物理性质及其生物学意义进行了系统性的介绍，基于膜电位驱动力原理对多种膜蛋白家族的功能机制给予了深入浅出的分析和阐释。
本书可以作为分子生物学和物理学专业本科生和研究生的结构生物学辅助教材、或者相关研究领域科研人员的专业参考书。
作者简介张凯，中国科学院生物物理研究所研究员，中国科学院大学生命科学学院教授。
1992年于美国俄勒冈大学物理系获得博士学位。
谨以此书纪念我的硕士研究生导师、理论生物物理学家徐京华教授感谢先生引领我从严谨的物理学书本步入多彩的生物学天地同时教导我在纷繁的大千世界中领悟普适的科学原理 ––张凯
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X.C.Zhang,Ph.D. 写在前面的话 随着结构生物学的蓬勃发展，传统的分类学式研究方法已渐显落伍；生物大分子的功能越来越多地为结构生物学家们所关注，而对于蛋白质功能的系统性研究将不可避免地涉及到对于相关动力学过程的分析。
从学科发展的角度来看，动力学研究将为结构生物学注入新的生命力，以期从一个全新的视角向人们展示膜蛋白结构的动态美感。
作为膜蛋白结构生物学的入门参考教材，本书的主要目的在于建立基于蛋白质结构和化学动力学的结构动力学研究语言和普适关系，促进膜蛋白结构动力学的定量化研究。
本书第一章简述膜蛋白结构分类、以及影响膜蛋白分子折叠和稳定性的因素。
第二章讨论生物膜与膜蛋白分子之间的相互作用、特别是膜电位的重要性。
第三章简述与本书相关的化学动力学基本概念，包括自由能景观函数和双稳态模型。
第四章涵盖二级主动转运蛋白的动力学问题，引入本书的核心概念—膜电位驱动力原理。
第五章讨论由ATP水解驱动的初级主动转运蛋白及其能量偶联问题。
第六章探讨离子通道的基本动力学性质。
第七章介绍与能量转化有关的主要膜蛋白家族。
第八章分析信号传导中G蛋白偶联受体的共性激活机制问题。
基于第
二、第三章所铺垫的基本概念，在第四到第八章的讨论中，笔者着力探索一条贯穿于各类功能性膜蛋白的结构动力学研究主线，而将针对具体膜蛋白家族的系统性讨论以及全面历史回顾谨托予众多更为丰富、细腻的专业化综述。
个别章节中所包含的、针对某些简化模型功能机制的推测性讨论旨在介绍结构动力学的基本分析逻辑和研究思路；具体推论的客观性、准确性仍有待学科的发展予以检验。
膜蛋白结构解析的技术方法理应是备受青年学生关注的话题，但由于其历史悠久、内容浩瀚、且日新月异，远远超出了本书的预设目标，故略而不表。
本书潜在的读者包括对结构生物学感兴趣的生物学和物理学专业的大学学生、研究生、以及需要温习化学动力学的从事膜蛋白结构研究的科研工作者。
本书的出版由中国科学院大学教材出版中心资助。

5 写在前面的话 一类自然现象是否可以用足够简洁的方式加以解释，取决于人们观察事物的视角和叙述问题的语言。
如果在阅读中，读者发现膜蛋白功能机制竟然可以是如此地简洁、普适、也因此而优美，笔者愿成为你的知音。

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X.C.Zhang,Ph.D. StructuralDynamicsofMembraneProteins PREFACE Eventhoughourstudyofprokaryoticandeukaryoticmembraneproteins(MPs)isreachingapointwherethenumbersofstructuresforeverymajorfamiliesareskyrocketing,traditionalapproachesalongtaxonomiclinesareswiftlyprovinginadequateforabetterunderstandingoftheiractualmechanisticbehaviors.Thestructure-functionrelationshipofthesebio-macromoleculesprovidedcriticalanddeepinsights;however,itisnowtimetoshiftattentiontowardstheequallyimportanticprocessesbehindtheirbiologicalfunctions.SuchanalysisofthedynamicfeaturesofMPsshouldgreatlyfacilitateabetterappreciationofthebiologicaleleganceofMPstructures,andprovideamuchneededdynamicperspectivehithertomissing. ThemajorpurposeofthisintroductorytextbookistodefinethenomenclaturenecessarytobetterunderstandthestructuraldynamicsofMPs,andtoidentifyuniversalrelationshipsdictatingsuchdynamics,basedoncurrentlyavailable3Dstructures,binationwiththewell-establishedtheoryofchemicalics.Chapter1introducestheclassificationofMPsbasedontheirstructures,anddiscussesthefactorsgoverningtheirfoldingandstability.Chapter2discussestheinteractionsbetweenMPsandtheirhostcellularmembranes,withemphasisontheimportanceoftheelectrochemicalpotentialforproperfunctioningoftheselargebio-macromolecules.Chapter3brieflyintroducesthebasicconceptsofchemicalicsrequiredforunderstandingthesubsequentchapters,includingthefreeenergylandscapefunctionaswellasthebistablemodel.Chapter4discussesthedynamicsofsecondaryactivetransporters,andintroducesthemembranepotential-drivingprinciple.Chapter5reviewsourcurrentunderstandingofATPhydrolysis-drivenprimaryactivetransportersandtheirenergycouplingmechanisms.InChapter6,thedynamicpropertiesofionchannelsarediscussedonthebasesofmonstructuralfeatures.Chapter7introducesthemajorfamiliesofMPs
7 PREFACE involvedincellularenergyconversion.Chapter8analyzesmonmechanismsresponsibleforactivatingGprotein-coupledreceptorsinvolvedinsignaltransduction.BasedonconceptslaidoutinChapters2and3,theremainingpartsofthebookexploreaunifiedapproachtostudyingthedynamicsofavarietyoffunctionalMPs.CertainspeculativediscussionsofsimplifiedmodelsofmolecularmechanismsofselectedgroupsofMPsarealsoincluded,tobetterillustratethebasiclogicandstrategyofstructuraldynamicsanalyses.Ofcourse,theobjectivityanduracyofthesemodelsandtheircorollariesremaintobeexperimentallyverified,andwillundoubtedlybefurtherrefinedbyfutureresearch.WhilethetechnicalmethodsofstructuredeterminationofMPsshouldbeofconsiderableintereststostudents,thosehadtobeexcludedduetothelimitedscopeofthisbook.Ihopetoreachbothcollegeandgraduatestudentswitheitherbiologyorphysicsbackground,interestedinawell-roundedintroductionintothefieldofstructuralbiology,butalsoresearchersalreadyworkingwithMPs,andwhoareinterestedinexploringthefunctionofMPsbeyondandabovetraditionalavenues. Whetheragivennaturalphenomenoncanbeexplainedwithsufficientsimplicitydependsbothontheparticularperspectivewelookatit,andwhetherappropriatelanguageischosentouratelydescribeit.Itrulyhopethatafterreadingthistextbook,thereaderwillagreewithmethatthemolecularmechanismsresponsibleforthefunctionofMPsaresimple,universal,andthusbeautifulexamplesofhowevolutionoflifehascreatedtoolswithwhichlifewasabletoconquerthemultitudeofecologicalnichescontinuouslyevolvingwithintheEarth’sbiosphere.
8 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. 目录 内容简介.........................................................................................................4
作者简介.........................................................................................................4
写在前面的话

......................................................................................................

5PREFACE..........................................................................................................7
目录....................................................................................................................9
第一章膜蛋白...................................................................................................15
§1.1生物膜与膜蛋白.....................................................................................16
§1.2细胞能量系统的“三驾马车”....................................................................19§1.3膜蛋白的结构研究.................................................................................23§1.4膜蛋白分类和结构稳定因素...................................................................26§1.5β桶型膜蛋白...............................................................错误!
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小结与随想..........................................................................错误!
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习题及思考题..................................................................错误!
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第二章生物膜与膜蛋白的相互作用........................................错误!
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§2.1生物膜的构成及性质...................................................错误!
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2.1.1生物膜的一般性质和化学组成.................................错误!
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2.1.2脂分子的物理聚集态...............................................错误!
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2.1.3表面张力和内部压强...............................................错误!
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2.1.4Gibbs自由能与Boltzmann分布............................错误!
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2.1.5生物膜与膜蛋白分子的相互作用.............................错误!
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§2.2疏水失配.....................................................................错误!
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§2.3膜电位与膜蛋白...........................................................错误!
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9 目录 2.3.1制约膜蛋白分子取向的“正电在内规则”...................错误!
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2.3.2膜电位—“活”细胞的标志.........................................错误!
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2.3.3跨膜的电荷迁移与膜电位的成因.............................错误!
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2.3.4膜蛋白对于其附近膜电位电场的影响......................错误!
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2.3.5静电驱动力与膜蛋白的构象变化.............................错误!
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小结与随想..........................................................................错误!
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习题及思考题..................................................................错误!
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第三章化学动力学基础..........................................................错误!
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§3.1酶促反应中的化学动力学............................................错误!
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§3.2能量景观函数..............................................................错误!
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§3.3热力学与动力学的区别和联系.....................................错误!
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§3.4双稳态模型..................................................................错误!
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3.4.1双稳态模型及其参数...............................................错误!
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3.4.2膜电位对双稳态模型的修正....................................错误!
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3.4.3化学势的别构驱动能力...........................................错误!
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小结与随想..........................................................................错误!
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习题及思考题..................................................................错误!
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第四章二级主动转运蛋白.......................................................错误!
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§4.1转运蛋白的一般概念...................................................错误!
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§4.2MFS转运蛋白家族.....................................................错误!
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4.2.1MFS转运蛋白的保守三维结构..............................错误!
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4.2.2结合能差GD—理解能量偶联的关键科学概念........错误!
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4.2.3转运蛋白分类以及机制差异....................................错误!
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X.C.Zhang,Ph.D. 4.2.4关于膜蛋白驱动原理的普适性.................................错误!
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§4.3APC家族....................................................................错误!
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§4.4CPA家族钠-氢交换泵.................................................错误!
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4.4.1NhaA及其同源蛋白................................................错误!
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4.4.2CPA3分支的唯一成员Mrp.....................................错误!
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§4.5RND转运蛋白以及AcrB的协同性..............................错误!
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4.5.1AcrB复合体的三维结构..........................................错误!
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4.5.2AcrB的三冲程机制.................................................错误!
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4.5.3质子化事件和能量偶联...........................................错误!
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4.5.4AcrB复合体三个亚基之间的协同性........................错误!
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4.5.5单亚基RND转运蛋白MmpL3的结构和转运机制..错误!
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4.5.6胆固醇转运蛋白NPC1............................................错误!
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小结与随想..........................................................................错误!
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习题及思考题..................................................................错误!
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第五章ATP驱动的跨膜转运...................................................错误!
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§5.1ATP水解酶的共性和多样性........................................错误!
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§5.2P型ATP酶—ATP驱动的离子泵................................错误!
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5.2.1P型ATP酶的共性结构..........................................错误!
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5.2.2肌浆网钙泵.............................................................错误!
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5.2.3Post-Albers循环以及解离态储能机制....................错误!
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§5.3ABC转运蛋白.............................................................错误!
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5.3.1I型ABC输出蛋白..................................................错误!
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5.3.2I型ABC输入蛋白..................................................错误!
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11 目录 §5.4脂多糖转运系统...........................................................错误!
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小结与随想..........................................................................错误!
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习题及思考题..................................................................错误!
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第六章通道蛋白.....................................................................错误!
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§6.1离子通道的一般概念...................................................错误!
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§6.2离子通道的结构和开关机制.........................................错误!
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6.2.1四聚体水通道..........................................................错误!
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6.2.2Ksc钾离子通道......................................................错误!
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6.2.3离子通道的疏水门闸...............................................错误!
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§6.3通道蛋白的门控机制...................................................错误!
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6.3.1机械力敏感通道......................................................错误!
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6.3.2电压门控机制..........................................................错误!
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6.3.3离子通道的快失活和慢失活机制.............................错误!
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6.3.4配体门控机制..........................................................错误!
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§6.4ClC氯离子通道...........................................................错误!
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6.4.1ClC蛋白分子的总体结构........................................错误!
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6.4.2通道亦或交换泵？..................................................错误!
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6.4.3ClC蛋白的功能切换...............................................错误!
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6.4.4ClC转运机制的结构基础........................................错误!
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小结与随想..........................................................................错误!
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习题及思考题..................................................................错误!
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第七章能量转化相关膜蛋白...................................................错误!
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§7.1ATP合酶.....................................................................错误!
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X.C.Zhang,Ph.D. 7.1.1ATP合酶的基本结构..............................................错误!
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7.1.2F1部分的ATP合成机制.........................................错误!
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7.1.3FO部分的转动机制.................................................错误!
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§7.2光合作用.....................................................................错误!
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7.2.1细菌视紫红质蛋白..................................................错误!
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7.2.2叶绿体与光合系统..................................................错误!
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7.2.3光系统I和II...........................................................错误!
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§7.3呼吸链复合体-I............................................................错误!
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7.3.1基本结构和能量偶联的一般机制.............................错误!
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7.3.2关于复合体-I的五个科学问题.................................错误!
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§7.4醌氧化酶驱动的质子泵................................................错误!
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7.4.1醌氧化酶的一般机制...............................................错误!
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7.4.2关于质子泵浦的关键科学问题.................................错误!
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7.4.3醌氧化酶复合体结构...............................................错误!
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小结与随想..........................................................................错误!
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习题及思考题..................................................................错误!
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第八章信号传导相关膜蛋白—GPCR.....................................错误!
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§8.1G蛋白偶联受体信号通路............................................错误!
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§8.2GPCR结构和共性结构元件........................................错误!
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8.2.1GPCR蛋白的一般结构...........................................错误!
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8.2.2A类GPCR中的保守模体.......................................错误!
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8.2.3GPCR蛋白激活过程的简化模型.............................错误!
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§8.3“质子转移”激活机制.....................................................错误!
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13 目录 8.3.1基态-激发态之间的结构差异...................................错误!
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8.3.2质子转移与激发变构...............................................错误!
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8.3.3保守模体在激发变构中的角色.................................错误!
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8.3.4A类GPCR的共性激活机制...................................错误!
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§8.4GPCR激活过程的双稳态模型.....................................错误!
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小结与随想..........................................................................错误!
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习题及思考题..................................................................错误!
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结束语....................................................................................错误!
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致谢........................................................................................错误!
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后记........................................................................................错误!
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附录........................................................................................错误!
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1.符号定义.........................................................................错误!
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2.常用热力学常数及换算....................................................错误!
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3.中英文对照表..................................................................错误!
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4.中国科学院大学教材专家会议审核意见...........................错误!
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参考文献.................................................................................错误!
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X.C.Zhang,Ph.D. 第一章膜蛋白 半亩方塘一鉴开，天光云影共徘徊。
问渠哪得清如许，为有源头活水来。
—《观书有感》朱熹 膜蛋白在细胞的跨膜物质转运、能量转化、信息传导、膜稳态维持等方面发挥着不可替代的作用。
是什么物理因素使膜蛋白分子区别于可溶蛋白质分子呢？膜蛋白分子具有哪些共性的结构特征呢？ 本章将讨论膜蛋白的重要性及其分类。
概括地说，存在两类主要的膜蛋白分子，即α螺旋束型和β桶型。
因为绝大多数功能性膜蛋白分子属于α螺旋束型并且将在后续各章中较详细地予以介绍，本章用一小节以β桶型膜蛋白为实例对膜蛋白分子的折叠过程和稳定性进行讨论。
关键概念：整合型膜蛋白；功能性膜蛋白；膜蛋白分子组装 15 第一章膜蛋白 §1.1生物膜与膜蛋白 生命进化至今已经历了逾40亿年的漫长历史（图1.1-1）。
大约35亿年 前，地球上出现了第一批原始细胞，正式 拉开了生物圈（biosphere）与岩石圈和 海洋圈分离过程的大幕[1]，开启了长达 20多亿年的、由原核细胞主宰生命世界 的时期。
直到12亿年前，发生了一件重 塑生物圈的重大事件—细菌在古细菌中的 内共生，即出现了第一代真核细胞，也就 是细胞内部还嵌套生物膜的系统。
在生物圈形成的最初20亿至30亿年间，生命世界进化出了在我们今天看似精巧得难以 图1.1-1生物圈的进化历程与生物膜的出现和功能化密切相关（引自SmithandMorowitz，2016） 置信的分子机器、生化通路和网络系统，为其后多细胞生命现象在地球上的繁 荣、包括我们人类的出现奠定了基础。
设想一下，没有生物膜的生物圈会是怎样 的一个混沌的世界？它仍然滞留在其原始阶段，表现为一些发生于水中和岩石缝 隙的、缺乏时空关联的化学反应。
生物膜不仅为细胞提供了一层物理边界，它的 横空出世也在原始生物圈与现代生命形式之间划出了一道鸿沟。
那么，本书的主角—膜蛋白—在生物圈中发挥着怎样的作用呢？细胞不是
一个热力学的封闭系统，它需要持续地与外界交换物质、能量和信息a，以维持远离热力学平衡态的准稳态。
这些交换和转化功能主要是由膜蛋白领衔完成的。
要理解细胞和细胞以上层次的生命现象，就不可能不涉及膜蛋白分子的结构和功能，也就是膜蛋白的结构动力学。
此外，由于承载着诸多早期生命世界中就已经出现的诸如营养摄取、能量转化、环境感知等基本生物学功能，膜蛋白可以视为我们认识生命进化的活化石。
众若繁星的膜蛋白分子是如何在进化中获得了今天 a能量和信息也被认为是物质的属性或者存在形式。
本书中则采用更通俗、直观的关于三者的区分。
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X.C.Zhang,Ph.D. 看似精巧绝伦的结构呢？它们的工作原理真的是像人们娓娓道来的那样千人千面，罕有共性可循吗？为了解答这类问题，我们需要研究膜蛋白的结构与功能之间的动力学关系，包括膜蛋白分子如何在自由能驱动下实现其存在的生物学意义a。
细胞、生物膜和膜蛋白分子之间有着怎样的几何关系呢？假如我们将细胞放大到西瓜的大小（直径比10µm:0.3m），生物膜也只不过是比A4纸略厚的一层外皮（厚度比5nm:0.1mm），其表面上点缀着这样那样的、小米粒般大小的各类膜蛋白分子。
在大多数情况下，膜蛋白仅占据着很小的膜表面（<5%）。
可能有读者会质疑这种说法：生化教科书中不是宣称生物膜含有约50%的干重来自蛋白质吗？在后面膜蛋白的分类中我们将看到，这些蛋白质分子并非都是直接、完全地镶嵌在磷脂双分子层中的。
因此，它们并不依照质量成比例地占据膜的表面。
除了完成生物膜两侧的物质、能量和信息 的传输—即所谓选择性通透，膜蛋白还担负着生 物膜的合成、稳态维持等任务，并且参与细胞之 间、以及膜被细胞器之间的相互作用等等。
许多 膜蛋白分子或者其复合体，与膜蛋白的折叠、组
装、修饰、以及膜生成或者细胞器生成直接相关（图1.1-2）。
毋庸置疑，从生物膜嵌入生物圈的那一时刻起，膜蛋白与生物膜就相互依存，互 图1.1-2生物膜与细胞关系示意图。
细胞和细胞器的形态主要是由生物膜界定的。
以对方为自身存在的必要前提。
尽管早期的膜蛋白不可避免地带有粗糙、易损、 多变等原始特征，它们依然顽强地履行着生物圈所赋予的使命。
a自由能表示一个满足特定热力学约束的系统所能输出的（非热学、有效）能量的上限。
例如，等温-等压约束下的封闭系统的自由能称为吉布斯自由能（Gibbsfreeenergy，记作G），它由美国著名物理学家Gibbs于1876年提出。
此类系统中的自发过程所对应的自由能变化G必然趋于减小。
Gibbs自由能常用于处理各种生物化学系统。
17 第一章膜蛋白 为了解释蛋白质分子与生物膜的结构关系，辛格（
S.JonathanSinger） 和尼克森（GarthNicoson）于1972年提出了膜蛋 白在生物膜中的液态镶嵌模型（fluidmosaic model；图1.1-3）[2]。
该模型的要点之一是膜蛋白分 子镶嵌在可流动的磷脂双分子层（lipidbilayer，简称脂双层）中，并且脂分子和膜蛋白分子都不断地发生着二维自由扩散。
随着对生物膜研究的不断深入，今天人们已经认识到，膜蛋白分子并非是游荡在脂双层中的、一颗颗孤立的刚性橄榄球。
这些蛋白质分子不仅持续发生着相对于脂双层的位移、转动和振动等类 图1.1-3膜蛋白与脂双层的液态镶嵌模型。
注：整合型膜蛋白用红色标记。
绿色标记的糖基化只发生在细胞质膜外侧。
（引自苏晓东等，2013） 型的热运动，而且其分子内部以及分子之间还不断地进行着多种构象转换。
与此 同时，磷脂双分子层为膜蛋白提供了一方发挥功能的舞台，并且主动地影响着膜 蛋白分子的性质和功能。
18 Structural
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X.C.Zhang,Ph.D. §1.2细胞能量系统的“三驾马车”在行使其功能时，绝大多数功能性膜蛋白分子需要能量来驱动。
生命细胞 中普遍存在着三大能量系统（图1.2-1）[1]：
（1）氧化还原势；
（2）以三磷酸腺苷酸（adenosine5’-triphosphate，ATP）为代表的含有‘高能’磷酸键的不稳定分子a；
（3）跨膜电化学势—它们分别类比于宏观世界中具有较高能量-质量比的储能物质、便携式通用电池、以及网络覆盖式动力电网。
三者彼此相互转化，维持着某种动态平衡；同时，也各自进化出独特的应用领域。
氧化还原能量常常被用于生物小分子（包括ATP）的合成b。
ATP是生物大分子多聚化的必要前题；从进化的角度来看，ATP的出现标志着生物圈由小分子世界向大分子世界转变的分水岭。
而跨膜电化学势则为细胞提供跨膜信号转导和物质转运所需要的驱动力。
本书将较为详细地讨论各类跨膜电化学势相关过程。
进而在第七章中我们将看到，在细胞三大能量系统之间的能量转化过程中，膜蛋白发挥着不可替代的作用。
三大能量形式的共性在于它们均涉及静电相互作用；同时，它们又各自具有其独特的物理化学基础。
化学中两个最基本的反应类型，氧化还原反应和酸碱反应，分别涉及电子和质子的转移。
由于水分子本身不具备稳定的外层电子空轨道，无法接收和传递电子，因而水溶液属于电子的不良导体c。
因此，氧化还原 a一个典型共价键的断裂需要吸收约340kJ/mol的输入能量；相反，ATP分子中磷酸键的断裂则可以释放30~50kJ/mol的能量。
b驱动原始生物圈的氧化还原势来自岩石圈与海洋圈的界面；现代生物圈的氧化还原势则来自光合作用。
而对于异养生物而言，有机小分子的降解是氧化还原能量的主要来源。
c事实上，人们用电导率检验水的纯度：电导率越小，纯度越高。
一般而言，水溶液的电导率是由离子型杂质所引起的，而并非借助电子迁移。
在强电场作用下，水分子也可能发生电离。
19 第一章膜蛋白 势可以不依赖于生物膜而稳定地存在，表现为电子在特定的电子供体与受体化合物之间所形成的结合能差。
电子的定向迁移正是由反应物之间的此类氧化还原势能差驱动的。
由于电子的负电性质，并且电荷与电压的乘积具有能量量纲，氧化还原势能更经常地用氧化还原电位来表示。
在没有外界能量输入的情况下，电子只可能自发地从具有较低氧化还原电位的化合物向较高氧化还原电位的化合物迁移。
氧化还原反应的这些性质使其成为生物圈的原始推动力。
在蛋白质（复合体）内部，电子长程转移的路径往往借助于具有非局域化电子结构的共轭键系统，例如金属簇、芳香环侧链基团或者杂环辅因子等。
另外，由于氧化还原反应涉及电荷迁移，一个给定基团的氧化还原势必然受到环境电场的影响。
譬如，正电性的外来电势场将提升该基团的氧化还原势，使其成为更强的电子受体，同时弱化其作为电子供体的能力。
当一对氧化还原反应的供体和受体同时受到均匀外电场的等强度影响时，上述效应可以忽略；相反，假如外电场选择性地影响两者之
一，氧化还原反应的速率将受到调制。
这一论点对于理解后文（例如第七章）中氧化还原势向跨膜电化学势的转化十分重要。
与电子相反，水溶液表现为优良的质子导体。
这是因为水分子中的氧原子具有外层sp3杂化轨道，即正四面体配位方式；后者在结合了两颗质子之后仍然可以接受另一颗‘多余’的质子，而不出现明显的静电排斥。
事实上，在水中自由质子的浓度极低，质子主要以水合质子（H3O+）的形式存在；这与水分子本身的高摩尔浓度（56摩尔）有关。
此外，相邻的水分子（或者其它含羟基的极性基团）极易形成动态的格罗图斯质子导线（Grotthussprotonwire），即在氧原子位置维持相对不变的前提下，质子发生快速的接力式迁移的路径。
因此，质子电化学势在水溶液中难以稳定存在，而只能借助生物膜来实现。
质子定向运动的驱动力来自质子化学势和外界电场两部分。
在自由扩散的情况下，化学势由浓度梯度决定；而在蛋白质内部的非自由扩散情况下，化学势由质子供体基团与受体基团之间的亲和力差别（即相对亲和力pKa）决定。
值得强调的是，正是由于生物膜系统的存在，使各类跨膜电化学势的出现成为可能，从而大大提高了细胞中能量转化的综合效率，即速率与效率之间的平衡优化；进而，也使物质、能量 20 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. 和信息在细胞中的流动和非均匀的空间分布得以在更为有序的方式中实现。
本质上，生物膜的出现、及其所衍生出的跨膜电化学势使一类‘全新’的物理能量形式—介观静电能a—进入了生命能源的主角之列。
与上文中相对亲和力pKa有关，我们需要定义绝对质子亲和力—pKa，b即当给定基团（X）发生50%质子化时环境的pH值。
pKa越高表示X基团获取质子的能力越强。
伴随质子从水溶液到X基团的迁移，pKa为pKa–pH。
pKa越大，X基团发生质子化的概率越高。
一般而言，人们只讨论所谓第一质子化的pKa。
譬如，碱性残基Arg的第一质子化pKa极高（取值13.6），表明Arg侧链可以稳定地结合一颗质子；即使水溶液中质子极度稀缺，这颗质子也很难解离。
然而，由于胍基电子轨道的平面性以及静电排斥作用，在Arg+基础上发生第二次质子化（即形成Arg2+）的可能性微乎其微，也就是说Arg+基团的pKa极小。
与电子供体或受体的氧化还原势类似，pKa并非是X基团的特征常数，而是一个极易受环境影响的可变参数[3]。
譬如，邻近基团Y的质子化将通过静电排斥力降低X基团的pKa，从而妨碍X由环境进一步获取质子。
但是，Y基团的质子化与否并不影响质子由Y到X的迁移潜能（即pKa）。
我们将会看到，作为一个实验可测量量和本书中被大量反复使用的概念，pKa与自由能差直接相关。
进而，溶液环境与膜蛋白内部的微环境相比，包括酸性氨基酸、组氨酸、半胱氨酸在内的可质子化滴定的氨基酸残基，其pKa值可能发生显著的变化。
譬如，在膜蛋白内部，酸性氨基酸残基的pKa可能升高到中性pH以上（例如据推测，细菌视紫红质蛋白中质子通路上的关键氨基酸残基Asp96的pKa甚至可以高达11）[4]；而某些组氨酸残基的pKa却有可能从pH7.6降低到6.0以下[5]。
此外，各类带电基团也可以通过氢键网络参与结合水分子或者水合质子，从而形成质子导线。
从结构生物学角度讲，高分辨率、单颗粒冷冻电子显微镜成像技术为判断一个酸性 a介观（mesoscopic），即细胞的尺度，所涉及的微观粒子数目一般大于104，同时远小于1012。
根据大数定理，其统计涨落（N-1/2）一般在百分之一到百万分之一之间。
b本书中如无特殊说明，pKa均专指质子，并且等于log10(Ka×1mol/L)。
其中Ka为质子结合常数，即解离常数Kd的倒数。
21 第一章膜蛋白 氨基酸残基是否已发生质子化、从而在电负性和电中性之间变化，提供了一种全新的、直接的、可视化实验手段[6,7]。
ATP所代表的磷酸化能量系统与氧化还原或者质子能量系统之间存在着诸多微妙的相似之处。
在磷酸化系统中，无机磷酸根基团（Pi）一般是从相对不稳定的高能态化合物（即Pi供体）向更稳定的低能态化合物（即Pi受体）自发地进行转移。
ATP是最常见的Pi供体，而水分子是最常见的Pi受体。
磷酸根基团由ATP向水分子的转移所释放的自由能即为ATP的水解能。
不难设想，反应物对磷酸根基团的亲和能力也可以用一个类似于质子pKa的量加以描述a。
在生命系统中，不胜枚举的酶可以催化ATP的水解，同时将该水解能偶联到其它需要自由能驱动的化学反应中b。
从细胞能源的重要性角度来看，膜电位与ATP可谓是不分伯仲的。
ATP常常被视为是比跨膜电化学势更为基本的能量储存形式。
譬如，人们将由ATP驱动的转运蛋白称为初级主动转运蛋白（primaryactivetransporter），而将由跨膜电化学势驱动的转运蛋白称为二级主动转运蛋白（secondaryactivetransporter）。
而实际上，由于三种能量形式之间的动态平衡及转换，上述主次区分带有明显的主观性。
此外，人们习惯上把跨膜电化学势作为ATP合成流水线的一部分来看待，然而这一观点显然远远低估了前者的重要性。
作为细胞的动力网络和信息网络的主干，跨膜电化学势的意义绝不亚于人类发展史上电气化和信息化的辉煌；事实上，相比于人类在200年前实现了依赖电力的第二次工业革命，生物圈利用电能的历史可以回溯到30亿年之前c。
a事实上，自由基（即化学基团缺失所造成的电子空轨道）的迁移、二硫键异构酶所涉及的二硫键的迁移、以及泛素化等等基团转移过程均可以用类似的“亲和力升高、自由能下降”的观点加以描述。
b当两个事件互为必要且充分条件，它们往往可以被视为彼此完全偶联，一般伴随有能量传输或者转换。
在零偶联与完全偶联之间，存在各种部分偶联的可能性。
c本书多处所使用的拟人化比喻仅仅出于阅读流畅性的考虑，而与亚里士多德式“目的论”毫无瓜葛。
22 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. §1.3膜蛋白的结构研究人类是视觉动物；“眼见为实”是实验科学的 一种基本理念。
结构生物学的目标之一在于为各类生物学观察、特别是分子生物学观察提供尽可能高分辨率的结构解释。
膜蛋白分子的三维结构解析始于20世纪70年代。
来自古细菌的细菌视紫红质蛋白（bacteriorhodopsin，bR）7Å分辨率的电镜结构发表于1975年（图1.3-1）[8]。
其跨膜区螺旋长度约为3.5纳米（35Å；1Å=10-10m），与磷脂双分子层中疏水部分的预期厚度相当。
该蛋白质的高分辨率晶体结构于1990年被报道[9]。
图1.3-1第一个膜蛋白结构—古细菌视紫红质蛋白的二维晶体的电镜结构。
左侧为多层电子密度图的叠合投影，右侧为据此重构的朴素三维结构。
（引自苏晓东等，2013） 在此期间，20世纪80年代，紫细菌光合反应中心（photosynthesis reactioncenter，PRCa）复合体的三维晶体结构 被成功解析[10]。
这一结构生物学中划时代的成果 使工作于同一楼层的三位德国科学家得以分享 1988年诺贝尔化学奖（图1.3-2）。
这一工作的 历史性意义在于它首次证明了，膜蛋白分子的
三 维结构可以像水溶蛋白一样利用X射线晶体学方法加以解析，而这样一类结论只有通过实验才可能得到确认。
更为重要的是米歇尔（HartmutMichel）博士开创性地使用了两亲性表面活化剂（去污剂）将膜蛋白分子从生物膜中溶解出来， 图1.3-21988年诺贝尔化学奖得主：
J.Deisenhofer（左）、
R.Huber、
H.Michel（右）。
左侧为第一个近原子分辨率的膜蛋白晶体结构。
a光合反应中心晶体结构的PDB代码是1PRC。
显然，作为开拓者的红利，早期结构生物学家可以为自己所钟爱的蛋白结构选择四联代码的后3位。
今天的结构生物学家在代码命名时则只能听任随机发生器的突发奇想了。
23 第一章膜蛋白 并且尽可能地维持了它们在天然状态下的三维结构。
（该纯化技术的可行性一般需要后续的体外功能实验加以验证。
）这些在今天看似再平凡不过的常规技术，在米歇尔生活的时代当属革命性的突破。
据说，当时鲜有人看好这项技术；一些同事们甚至对米歇尔‘浪费’自己的职业生涯表示无耐的同情。
但是，他的原创性、前瞻性、以及超乎常人的执着终于使他跻身膜蛋白研究领域佼佼者的行列。
两名美国科学家阿格雷（PeterAgre）和麦金龙（Roderick MacKinnon），2003 年因生物膜水通道[11] 和离子通道[12]的结构 和功能研究，问鼎诺 贝尔化学奖（图1.3- 3）。
2012年，斯坦福大学的科比卡（BrianKobilka）教授，因为解决了生物信号经由GPCR受体蛋白向下游G蛋白传 图1.3-32003年诺贝尔化学奖得主：
P.Agre（左）、
R.MacKinnon（右）。
左侧为水通道蛋白复合体的局部结构卡通图。
图1.3-42012年诺贝尔化学奖得主之一：
B.Kobilka。
图中所示蛋白质结构为激发态GPCR与下游G蛋白复合体结构沿三个彼此垂直的方向的投影。
（引自Rasmussenetal，2011） 导的分子机制问题，而摘得了诺贝尔化学奖的桂冠（图1.3-4）[13]。
回顾一下， 第一个膜蛋白结构有关的诺奖与能量代谢有关；第二个与物质输运有关；而第
三 个则与信号传导有关。
三者正是膜蛋白最具代表 性的功能。
中国科学家在膜蛋白结构研究方面也取得
了令人瞩目的成就。
这一历史始于2004年：中国科学院生物物理研究所常文瑞院士和植物所匡廷云院士共同主持完成了菠菜主要捕光蛋白复合体的晶体结构测定（图1.3-5）[14]，继胰岛素结构解析 图1.3-5中国科学家解析的第一个膜蛋白晶体结构—菠菜主要捕光蛋白复合体。
（引自Liuetal，2004） 24 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. 之后，为中国结构生物学的发展又增添了浓墨重彩的一笔。
蛋白质是细胞生命过程的重要执行者；而膜蛋白所扮演的角色使细胞得以成为生命的基本单元。
从细菌到哺乳动物细胞，膜蛋白形成了众多高度保守的蛋白质家族，行使着多种最基本的生物学功能。
正因为如此，膜蛋白与多种人类疾病密切相关，并且成为重要的药物靶标。
与其重要性相比，目前膜蛋白的结构研究仍然存在着较大差距：在人类基因组中，约30%的蛋白质基因参与编码膜蛋白（其余编码可溶蛋白）；而国际上最权威的蛋白质结构数据库（ProteinDatabank，PDB）中，膜蛋白的结构数目仅占2%左右。
从一个乐观的角度来看，膜蛋白的结构和功能研究拥有着广阔的发展空间。
25 第一章膜蛋白 §1.4膜蛋白分类和结构稳定因素为了清晰地界定研究对象及其范围，每一门学科都需要明确的分类方法， 梳理主要对象与次要对象以及环境因素之间的关系。
对于膜蛋白来说，结构分类与其所处环境、折叠方式、以及影响稳定性的物理化学因素等密切相关。
根据所参与的生物学过程，膜蛋白可以划分为功能性和结构性两类。
参与 物质、能量和信息流动的膜 蛋白，均属于典型的功能性 膜蛋白；而结构性膜蛋白， 则主要作为膜组分来调控生 物膜的物理性质，以及建立 膜与内外环境的结构性联 系。
本书将主要关注功能性 膜蛋白，特别是它们的动力 学机制的结构基础。

取决于来源的不同和 图1.4-1膜蛋白分类。
本书重点关注多次跨膜的α螺旋束型膜蛋白。
纯化技术的差异，细胞的膜组分中10%至50%的质量来自蛋白质。
然而这一质 量比例并非意味着脂双层和蛋白质平分秋色、各占50%的膜表面。
与膜之间存 在着直接相互作用的蛋白质分子可以划分为膜依附蛋白和膜蛋白（图1.4-1）。
•其中，膜依附蛋白可以与其它膜蛋白分子或者脂分子以范德华力、疏水力、静电力、氢键等非共价方式相互作用a，借此依附于膜表面；而膜蛋白可以划分为锚定蛋白和整合型膜蛋白。
a本书采用力的物理学定义：广义力（F）等于能量（E）对于广义位移的微分，并且取负值，即F=–
E。
通俗地讲：只要存在局部的势能差，就存在力。
附注：范德华力（VanderWaalsforce）是一类亚纳米尺度上是‘万有引力’，一个基团可以与多个其它基团同时发生范德华相互作用；其主要来源是共享电子云的量子效应。
一个宏观的例子是有着分形结构、因而有效表面积 26 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. •锚定蛋白借助脂修饰（诸如发生于胞质侧的棕榈酰化、法尼基化、豆蔻酰化、以及发生于哺乳动物细胞外侧的糖基磷酯酰肌醇化）或者其它共价键连方式定位到磷脂双分子层表面；而整合型膜蛋白（亦称跨膜蛋白）又可以划分为单次跨膜和多次跨膜。
•单次跨膜蛋白顾名思义仅含有一根跨膜螺旋。
多次跨膜蛋白又可以划分为α螺旋束型和β桶型。
•α螺旋束型膜蛋白出现在细胞质膜、内质网膜、线粒体内膜等处。
相反，β桶型膜蛋白只出现在革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体的外膜，以及作为外源毒素的穿孔型膜蛋白。
由此不难看出，许多与膜结构相关的蛋白质并不包含跨膜部分，或者只具有一次跨膜螺旋。
即便是多次跨膜蛋白，它们镶嵌在膜内的部分也常常远小于定位在膜外的部分。
以后各章将主要讨论由跨膜螺旋束所构成的整合型膜蛋白的结构及其功能。
谈到蛋白质分子的结构，必然涉及肽链的折叠和稳定性。
水溶性蛋白的折叠被认为是由疏水内核的形成、以及分子内部氢键所共同驱动的[15]。
然而在膜蛋白分子的折叠过程中，由于脂双层环境本身就呈现强疏水性，疏水内核的重要性相比于水溶性蛋白来说显得较弱。
因此，曾经有研究者提出，膜蛋白表现为一种反穿皮袄（inside-out）的折叠方式，由亲水内核规避疏水性脂双层环境这样一类热力学过程来驱动膜蛋白分子的折叠。
换言之，疏水性残基更多地暴露于蛋白分子表面那些接触磷脂双分子层的部分，而亲水性残基则包埋在蛋白内部以便远离疏水性脂分子。
虽然这种描绘方式体现出一定的合理性，但绝非铁律。
事实上，在比较稳定的膜蛋白分子中，常常也可以发现堆积紧凑的疏水内核。
基于膜 很大的壁虎的爪子对于各类岩壁的普遍吸附能力。
与范德华力形成鲜明对照，质子供体与受体之间的氢键具有明显的方向性和饱和性。
27 第一章膜蛋白 蛋白所呈现的稳定性不难推测，这类疏水内核相互作用一般应该强于蛋白肽链与脂分子环境之间的相互作用。
膜蛋白结构表现出以下共性特点：
（1）膜蛋白分子内部，跨膜螺旋彼此之间的堆积比较紧密，短侧链的氨基酸残基比较多。
这种结构致密性可能有利于避免极性小分子（包括水分子）的随机渗入。
特别是在位于彼此发生构象变化的结构域界面处，此类短侧链残基的可能构象数目较少，相应的构象熵较小，便于界面快速地封闭。

（2）色氨酸等大环残基常常以带状形式出现在膜蛋白分子与脂双层内外表面的交界处。

（3）膜蛋白分子的跨膜区表面的某些凹陷处与脂分子发生特异性结合。

（4）膜蛋白分子内部也可能包埋一些与功能有关的水分子，在高分辨率结构中尤为明显。
在第二章中我们将讨论到，跨膜螺旋常常通过改变相对于膜平面的倾斜角度来改善与脂双层自然厚度的匹配程度。
一般而言，两者匹配得越好，膜蛋白分子就越稳定。
进而可以推测，当所受外力发生变化时，过长或者过短的跨膜螺旋往往对应着更高的构象变化灵活性；与之相反，与脂双层完美匹配的跨膜螺旋则更经常地发挥锚定作用，将外力传导、耗散到膜环境。
此外，膜的表面张力和内部压力等物理因素均可以影响膜蛋白分子的构象。
一方面，对于携带电荷的膜蛋白分子而言，电荷彼此之间以及电荷与膜电位之间的静电力对于蛋白分子的构象乃至功能产生着深刻的影响；另一方面，与膜电位的静电相互作用是一个迄今尚未受到普遍重视的、有关膜蛋白物理化学的重要课题。
一个给定膜蛋白分子的构象是所有上述诸多因素共同作用的综合结果。
然而，使用去污剂溶解出来的膜蛋白分子所受到的环境张力、压力、静电力等等作用可能会显著地不同于体内脂双层环境。
由于这种区别的存在，人们借助去污剂所解析的膜蛋白结构、特别是其动态性质与原位相比就可能发生预想不到的变化。
事实上，借助不同纯化技术、并且在体外环境下被稳定的膜蛋白样品可以表现出显著不同的动力学性质[16]。
当人们期望基于体外结构研究去理解体内功能 28 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. 时，膜蛋白与水溶性蛋白相比又添加了一分不确定性。
因此，对于膜蛋白结构的细致解释，人们需要抱持一种审慎的态度。
基于蛋白质折叠过程的简约性和膜蛋白的结构稳定性要求，整合型膜蛋白 主要划分为两大类：α螺旋束型和β桶型（图1.4-2）。
在整合型膜蛋白的跨膜 区，几乎不出现α-β有序交替型（即α/β）或者α-β分域型（即α+β）等混合折 叠方式。
究其原因，在蛋白质的折叠过程中，存在两大类主要的驱动力：一类来 自疏水相互作用（外因）；另一类是氢键（内因）。
膜蛋白进入磷脂双分子层是 由疏水力驱动的。
也就是说，通过与脂双层的疏水部分相互作用，膜蛋白中的疏 水性残基得以规避与水溶液的直接接触，从而不必为维持界面去支付与负熵有关 的自由能。
可以认为，生物膜充当着膜蛋白的天然分子伴侣。
离开了生物膜（或 者去污剂），膜蛋白肽链毫无悬念地将发生高聚甚至沉淀，并且常常失去天然构 象。
在个别情况下，膜蛋白分子的内部稳定性极强，在通过高聚化规避水环境的 同时，仍然能够在一定程度上维持天然构象；此类膜蛋白分子有可能通过无细胞 蛋白表达体系进行体外合成，进而使用表面活化剂加以溶解[17]。
特别重要的是， 由于磷脂双分子层内部的疏水环境无法提供成氢键基团，肽链中大致等量的氢键 供体和受体基团唯有通过内部的
氢键网络才能实现极性基团的自由能最小化。
因此，对于膜蛋白折叠而言，具备规律性氢键网络的α螺旋和β桶结构几乎就成为了仅有的选择。
在少数细菌的外膜中，人们发现了一类由一或两 图1.4-2α螺旋（α-helix）和β桶（β-barrel）型膜蛋白的结构特征和比较。
首先，膜蛋白中α螺旋均为右手型。
其中一个残基的羰基氧Oi与其后第四位残基的氨基氮Ni+4形成氢键。
α螺旋的基本参数：每个残基旋转100；每圈螺旋平均含3.6个残基。
每个残基上升1.5Å；螺旋的螺距为5.4Å。
垂直于膜平面的α螺旋，其跨膜区含有大约23个残基，6.5圈螺旋。
螺旋N端的主链氨基基团表现为正电性；相反，C端的主链羧基基团呈现负电性。
因此，螺旋的静电性质表现为一个静电偶极子。
第
二，β桶型膜蛋白中，相邻β片均采取反平行，主链平行线之间距离约为5Å。
所形成的链间氢键之间近似平行；氢键间距宽窄交替变化。
β桶型膜蛋白分子的横截面多为不规则椭圆。
29 第一章膜蛋白 条β片（β-strands）盘绕形成的、螺旋形膜蛋白，例如短杆菌肽（gramicidin）。
此类跨膜蛋白质分子同样也拥有封闭的氢键系统，并且可以与磷脂双分子层形成有效的疏水相互作用。
然而，其简单紧凑的结构使这类跨膜折叠所能承载的功能种类极为有限，因而现身寥寥。
在上述两类主要膜蛋白结构类型中，由跨膜α螺旋构成的整合型膜蛋白是 更为常见的形式，并且可以通过生物信息学加以可靠地预测。
随着基因组学的发 展和成熟，越来越多的物种基因组已经或正在被批量化地测定。
由此可以预测出 大批蛋白质的一级结构，即肽链的氨基酸序列。
进而，在生物信息学领域，人们 已经学会根据氨基酸序列预测肽链的二级结构，即由氢键决定的
α螺旋或者β片 层（β-sheeta）等结构元素。
预测α螺旋的准确度已经达到80%以上，高于对 于β片层的预测。
其原因在于，α螺旋是一种由局部氢键维系的低能态结构单 元，而β片层则需要由肽链中相距较远的部分以主链氢键的形式相互作用来实 现。
相对而言，预测局部相互作用比较容易，因此α螺旋更容易被正确地识别。
值得称道的是，贝克（DavidBaker）实验室的研 究者于2018年首次报道了有关人工设计的、跨膜 α螺旋束型膜蛋白三维结构的研究[18]；进而，又 于2021年发表了独具匠心的桶型膜蛋白的人工 设计原理和结构验证[19]。
这些里程碑式的研究成 果展示了，人们对于各类调控膜蛋白折叠和稳定性的关键因素的认识水平达到了一个全新的高度。
根据对人类基因组的生物信息学分析，人们预测了膜蛋白中α螺旋数目的分布[20]。
总体来看，多种不同算法所给出的预测结果是基本一致 图1.4-3基于人类基因组分析的膜蛋白跨膜螺旋的分布预测。
横轴是跨膜螺旋的次数，纵轴是相应类型的膜蛋白的出现频率。
所使用的8种算法的结果以不同颜色表示。
附图是对膜蛋白类型的说明。
（引自Fagerbergetal.，2010） a关于本书中采用的二级结构的中文命名请参照附录
3。
注：β片层看起来是不是颇似中国古代的竹简？ 30 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. 的（图1.4-3）：一次跨膜的膜蛋白数量最多；膜蛋白出现频率随跨膜螺旋数目增加而依次减少。
但是存在一个例外，即含七次跨膜螺旋的膜蛋白异常丰富。
这一现象部分地是因为存在着一支庞大的膜蛋白家族—G蛋白偶联受体（Gproteincoupledreceptor，GPCR），其表现出七次跨膜螺旋束的结构特征。
对此，我们将在第八章展开详细的讨论。
至于为什么不是更大或者更小的跨膜螺旋束成为最受青睐的折叠形式，可能带有进化过程的偶然性。
螺旋的数目对于膜蛋白的拓扑结构极为重要。
譬如，由对称轴平行于膜平面的所谓反式对称性（inversesymmetry）所联系的两个偶数螺旋束所形成的结构域之间，需要奇数根螺旋相连接；而由平行于膜平面法线的二重轴所联系的此类结构单元之间，则需要偶数（或者零）根螺旋相连接。
对于一次跨膜的蛋白质分子而言，氨基端（N末端）位于胞外侧的类型被定义为I型膜蛋白。
大部分细胞表面受体属于此类膜蛋白[21]。
而N末端定位于胞内侧的类型称为II型膜蛋白。
在被预测的II型膜蛋白中，又有相当一部分可能属于分泌型蛋白。
由这类II型膜蛋白变化而来的分泌型蛋白与I型膜蛋白之间的区别，仅在于是否含有羧基端（C末端）跨膜螺旋将其锚定在脂双层中。
在蛋白质成熟之后，它们所含有的作为信号肽的氨基端（N端）跨膜螺旋均被信号肽蛋白酶剪切掉了。
31 第一章膜蛋白 在以后各章中将要讨论的大多数整合型膜 蛋白属于α螺旋束型的多次跨膜蛋白，而并非上 述I型或II型膜蛋白。
为此，我们首先探讨一下这 类多次跨膜蛋白究竟如何完成其折叠（图1.4- 4）。
膜蛋白的折叠过程有着不同于水溶性蛋白的特殊性。
膜蛋白新生肽链的N末端常常需要带有膜定位信号，以区别于水溶蛋白。
此外，膜蛋白折叠一般需要其它蛋白质分子的协助，譬如一类膜定位机器—易位子（translocon，或者称insertase），它们可以协助膜蛋白的新生肽链正确地定位于磷脂双分子层中[22]。
存在着彼此同源 图1.4-4膜蛋白折叠需要易位子的协助。
注：核糖体，青蓝色；mRNA，红色；磷脂双分子层，深灰色；易位子，橙色；新生肽链，绿色。
上方为胞质侧；下方为胞外侧或者内质网腔体侧。
的两类易位子，其中一类的胞质侧附带有正电性结构域，可以与核糖体结合，催 化伴随翻译过程的转移（co-translational translocation）或入膜折叠；另一类不与 核糖体结合，催化翻译后转移（post- translational
translocation）。
在第一类 易位子情况下，核糖体在合成膜蛋白肽链 时，几乎是‘坐’在易位子表面，与之紧密对接[23]。
对于含有多次跨膜螺旋的膜蛋白而言，随着新生的肽链从N端到C端的不断延伸，疏水性肽链在膜表面逐段折叠成α螺旋（图1.4-5）[24]。
相继的疏水性 图1.4-5α螺旋型膜蛋白的折叠过程。
注：易位子，青蓝色；疏水性螺旋，红色；亲水性肽链，绿色。
A图，多次跨膜蛋白；B图，（II型）单次跨膜蛋白。
（引自Cymeretal.，2014） 螺旋常常成对地形成发卡结构，在疏水力的作用下，迅速嵌入膜中。
然而，发卡 的顶端（即连接端）一般属于亲水性的肽链；在穿越疏水性脂双层的过程中，它 们需要克服可观的能量势垒[24]。
事实上，易位子本身也属于
α螺旋束型的膜蛋白。
[25]已知最复杂的易位子系统来自粗面内质网—真核细胞中由核基因编码的膜蛋白分子的合成场所。
32 StructuralDynamicsofMembraneProteins2021-06-22
X.C.Zhang,Ph.D. [26]这个称为EMC（ERplex）的复合体，含有9个亚基，远比细菌中的易位子（例如YidC）来得繁复。
除跨膜部分之外，EMC还含有很大的胞质侧和腔体侧部分，用于招募客户肽链（clientpeptide）、以及协调客户蛋白入膜折叠之后的各种修饰和组装。
然而，易位子的基本功能是相对简单的：它们提供了一条位于磷脂双分子层（胞质侧）内小叶的亲水性凹槽，协助客户肽链的亲水性部分克服疏水能量势垒。
形成该凹槽的易位子跨膜螺旋往往比较短并且亲水性略强，导致其附近的磷脂双分子层变薄，有利于客户肽链的亲水部分的跨膜转移、以及疏水部分从易位子解离并且发生横向扩散。
在膜蛋白的折叠过程中，疏水相互作用提供着大部分客户肽链嵌入或穿过脂双层所需的驱动能量。
在决定相对于脂双层的取向方面，来自客户肽链的跨膜螺旋总体上遵从一个“正电在内规则”（参见§2.3）；与之相应，易位子凹槽的中间部分一般呈现正电荷，阻碍携带正电荷的客户肽链向胞外侧（或者内质网腔体）的跨膜位移。
上述膜蛋白折叠模型得到了单分子力谱学实验（singlemoleculeforcespectrum）的支持[27]。
譬如，在其去折叠过程中，细菌视紫红质蛋白表现为分步解聚，每一步骤仅被抽提出两根跨膜螺旋。
而将一对跨膜螺旋抽提出磷脂双分子层大约需要100pN的外力，相应的疏水相互作用能量是相当可观的。
类似的去折叠现象在真核膜蛋白中也被证实[28]，提示了该模型的普适性。
在易位子之外，膜蛋白的折叠过程、特别是膜蛋白复合体的组装往往还需要多种辅助因子和组装因子（前者可成为复合体的组成部分，而后者不出现在成熟复合体中）。
譬如，膜蛋白肽链在胞质侧的脂修饰、胞外侧（或者内质网腔体侧）的二硫键的形成和异构化、糖基化、辅酶的嵌入、组装中间体的稳定化等等与折叠和组装有关的翻译后‘修饰’一般都是在特定酶或者分子伴侣的指导下完成的[29]。
同时，膜蛋白的降解也是细胞蛋白质质量控制系统的必要组成部分。
膜蛋白降解过程中的一个关键步骤是将嵌入脂双层中的肽链抽提出来，并且交由后续的蛋白酶进行剪切。
这个抽提步骤由一类ATP水解能驱动的、动态右手螺旋状六聚体形式的、线性分子马达（linearmolecularmotor）执行[30]。
马达中六个同质亚基仿佛六只小手，以交替结合、循环渐进的方式，自N端向C端方向沿客 33 第一章膜蛋白 户肽链依次前行；每水解一枚ATP分子，马达复合体仅仅前进一个氨基酸残基，并且将客户肽链原有的二级结构不加区别地转变为伸展构象a。
由此可见，与其强大的折叠能相对应，针对膜蛋白肽链的抽提过程需要消耗可观的能量。
在研究蛋白质折叠的计算中，人们使用一个叫作接触序参数（contactorder）的量来描述折叠过程[31]。
在简单的、由肽链中近程相互作用主导的折叠过程中，接触序参数较小；而需要肽链中长程相互作用的折叠，它们的接触序参数较大。
比如说，像我们“中国结”这类经纬交织的折叠或者构象，它的接触序参数就很大，需要技术熟练的工人来制作。
虽然类似的蛋白折叠很可能具有高度的稳定性，但是由于其折叠的动力学过程过于繁琐，没有什么蛋白质分子可能具有此类拓扑结构。
事实上，在发生可能的翻译后共价修饰（例如形成二硫键）之前，没有任何已知蛋白质肽链（无论是膜蛋白还是水溶性蛋白）具有打“死结”的拓扑结构。
值得特别地指出，膜蛋白结构中的跨膜部分接触序参数一般都很小；其折叠的拓扑结构比较简单。
因此，某些研究者认为，膜蛋白可以作为一类研究蛋白质折叠、堆积的理想实验系统。
a双链DNA解旋酶也使用类似的线性分子马达机制。
马达沿着其中一条DNA链前进，迫使双链分离。
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