学校编码：10384分类号密级学号：259UDC 硕士学位论文 库高效快速的CHO细胞稳定表达平台的要初步建立 摘ConstructionofCHOcelllinesforhigh-efficient文expressionofbinantproteins士论杨奕 硕指导教师姓名：罗文新副教授博专业名称：细胞生物学学论文提交日期：2016年4月大论文答辩时间：2016年5月厦门学位授予日期：2016年6月 答辩委员会主席：赵勤俭教授评阅人：季明芳教授 2016年5月 于楠副教授 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立完成的研究成果。
本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 库在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研究生学 术活动规范（试行）》。
要另外，该学位论文为厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技摘术研究中心课题组的研究成果，获得国家级传染病重大专项子课题级文（2013ZX10002002）与国家级863计划（2012AA02A307）经费的资论助，在厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心完成。
硕士声明人（签名）：厦门大学博年月日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办 法》等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 库学位论文（包括纸质版和电子版），允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。
本人同意厦门大学将学位论文加入全国 要博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。
文本学位论文属于：论（）
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硕（√）
2.不保密，适用上述授权。
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此声明栏不填写的，默认为厦门公开学位论文，均适用上述授权。
） 声明人（签名）： 年月日 库要摘文论士硕博学大门厦 目录 目录 摘要...........................................................................................................V
Abstract

..................................................................................................

VII缩略词(Abbreviation)...........................................................................Ⅸ 库第一章前言................................................................................................1
要1抗体药物的发展与现状....................................................................................1 1.1抗体药物发展历程...................................................................................1 摘
1.2国内外单抗药物产业现状.......................................................................3文2抗体药物的表达系统........................................................................................7 2.1
筛选标记的选择.......................................................................................7 论
2.2宿主细胞的选择.....................................................................................10
士2.3转染方法.................................................................................................11 3
细胞株的筛选流程及工艺优化......................................................................14 硕3.1细胞株筛选流程.....................................................................................14
博3.2细胞株筛选方式.....................................................................................17
学3.3无血清培养工艺.....................................................................................20 4
重组药物生产过程细胞质量控制..................................................................20 大4.1细胞稳定性研究.....................................................................................21
门4.2生产过程细胞质量控制.........................................................................21 4.3重组工程细胞库的建立与鉴定.............................................................22 厦5本论文的研究目的与意义..............................................................................23 第二章材料与方法..................................................................................25 1材料...................................................................................................................25
1.1主要仪器.................................................................................................25
1.2主要试剂与材料.....................................................................................26
1.3主要溶液配方.........................................................................................28
I 目录 2
方法...................................................................................................................29
2.1常规分子生物学实验方法.....................................................................292.2常规细胞生物学实验方法.....................................................................332.3细胞株的筛选.........................................................................................35 第三章结果与分析
..................................................................................38 1表达载体的构建..............................................................................................38
2转染方法的选择与优化..................................................................................40 库2.1质粒的准备.............................................................................................40
要2.2阳离子聚合物PEI..................................................................................42 2.3
电穿孔.....................................................................................................43 摘
3利用荧光蛋白进行细胞株筛选过程的确定..................................................46文3.1一轮加压筛选..........................................................................................47 3.2
二轮加压筛选..........................................................................................49 论
4高产细胞株的筛选..........................................................................................51
士4.1无血清贴壁培养的摸索.........................................................................51 4.2候选细胞群体的获得.............................................................................52 硕4.3候选细胞群体的加压筛选过程.............................................................54博4.4候选细胞群体的单克隆化.....................................................................55 4.5细胞株产量评估.....................................................................................56 学
4.6细胞株表达产物的纯化与分析...........................................................569大第四章讨论..............................................................................................61
门1宿主细胞株的选择..........................................................................................61 2
转染方式的选择与优化..................................................................................62 厦3细胞株筛选流程的优化..................................................................................63 第五章小结与展望
..................................................................................65参考文献..................................................................................................67
致谢..........................................................................................................74 II Contents Contents Abstract
inChinese..................................................................................VAbstract

..................................................................................................

VIIAbbreviation............................................................................................Ⅸ 库
Chapter1Preface.....................................................................................1要1Thedevelopmentandstatusofantibodyindustry..........................................1 1.1Thedevelopmentofantibodyindustry......................................................1 摘1.2Thestatusofmonoclonalantibodyworldwide..........................................3文2Expressionsystem..............................................................................................7 2.1
Selectionmarkers.......................................................................................7 论
2.2Hostcells..................................................................................................10
士2.3Transfectionmethods...............................................................................11 3Optimizationofselectionflowchart...............................................................14 硕3.1Flowchartofcelllineselection................................................................14博3.2Patternsincelllineselection....................................................................17学3.3Cellcultureinserum-freemedium..........................................................20 4Cellqualitycontrol..........................................................................................20 大
4.1Cellstability.............................................................................................21
门4.2Qualitycontrol.........................................................................................21 4.3
ConstructionofWorkingCellBank.........................................................22 厦5Thepurposeandsignificanceoftheresearch................................................23 Chapter2Materialsandmethods.........................................................25 1Materials...........................................................................................................25
1.1Instruments...............................................................................................25
1.2Reagents...................................................................................................26
1.3Medium....................................................................................................28 III Contents 2
Methods.............................................................................................................29
2.1Molecularcloning....................................................................................292.2Cellexperiment........................................................................................33
2.3Celllineselection.....................................................................................35 Chapter
3Resultsandanalysis..............................................................38 1Constructionofplasmids.................................................................................38
2Optimizationoftransfectionmethods............................................................40 库2.1Linerizationandpurificationoftheplasmid............................................40要2.2PEItransfection........................................................................................42 2.3
Electroporation.........................................................................................43 摘
3GFPandmCherry............................................................................................46
文3.1Selectionphase1......................................................................................47 3.2
Selectionphase2......................................................................................49 论
4Selectionofcellline..........................................................................................51
士4.1Cellcultureinserum-freemedium..........................................................51 4.2Selectionofcandidatecellpools..............................................................52 硕4.3furtherselectionofcandidatecellpools..................................................54博4.4Cloningofcandidatecellpools................................................................55 4.5Evaluationofcelllines.............................................................................56 学4.6Proteinpurificationandanalysis............................................................569大Chapter4Discussion..............................................................................61门1Selectionofhostcells.......................................................................................61 2
Optimizationoftransfectionpatterns............................................................62 厦3Optimizationofselectionflowchart...............................................................63 Chapter5Summaryandprospect........................................................65Reference.................................................................................................67
Acknowledgement...................................................................................74 IV 摘要 摘要 作为抗体药物的主力军，单克隆抗体（Monoclonal
antibodies,简称mAbs）已成为世界生物制药行业的研究热点。
本实验室已研制出具有开发为创新药物潜力的抗体需要进行大量表达用于临床前研究。
抗体药物在开发阶段以及产业化阶段需要以稳定表达的方式进行生产，因此建立一个高效快速的稳定细胞株筛选平 库台对推进抗体药物的研发进程具有重要意义。
本研究首先构建了真核细胞表达质粒pNIDVD-GFP&mCherry，以绿色荧光 要蛋白GFP与红色荧光蛋白mCherry为荧光报告蛋白，将细胞株筛选流程可视化；摘以CHO-
S、CHODG44、CHOK1为备选宿主细胞，开展包括宿主细胞的选择、 转染方法的优化、加压筛选策略的调整等探索，初步建立了稳定细胞株筛选流程。
文转染效率是影响细胞株产量的因素之
一。
研究中发现，相比于常规转染方法，论电穿孔法作为一种物理转染方法更适用于多种细胞。
通过对电穿孔仪、电穿孔缓士冲液、质粒用量、电压、宿主细胞等的摸索，将CHO-
S、CHODG44、CHOK1 三种细胞在BTXAgilePulse™MAX中的转染效率分别由5%左右提高至 硕80.27%、59.20%、52.60%，满足稳定细胞株筛选的需要。
本研究选用转染效率博最高的CHO-S细胞作为宿主细胞。
为进一步提高细胞株筛选效率，本研究对筛选过程中嘌呤霉素与甲氨蝶呤 学（Methotrexate，简称MTX）的加压浓度进行梯度摸索，获得最佳药物浓度范围。
大同时发现嘌呤霉素与MTX同时加压比单独嘌呤霉素或MTX加压对荧光蛋白的 表达更为有利，还发现两轮加压有利于荧光蛋白表达量的提高。
经过以上探索， 门初步确定了稳定细胞株筛选的条件和流程。
厦将上述条件和流程应用于乙肝人源化抗体E6F6hAb-162的稳定细胞株筛选， 将电穿孔法转染48小时后的细胞接种于96孔板内，21天后进行ELISA检测。
挑选产量大于0.3mg/L的候选细胞群体进行放大培养，经过14天流加培养评估，筛选出5个产量大于40mg/L的候选细胞群体。
增加嘌呤霉素与MTX的浓度，对这5个候选细胞群体继续加压筛选，获得5个产量大于100mg/L的细胞群体。
同时对这5个候选细胞群体进行克隆化，获得产量大于150mg/L的细胞株4个，
V 摘要 最高产量可达225.12mg/L，该产量可以满足临床前评价对细胞产能的需求。
本研究建立了一种快速高效的稳定细胞株构建方法，能够在15周内获得高 产细胞株，为进一步大规模哺乳动物细胞培养生产抗体奠定了基础，有利于获得大量抗体以满足临床前各类抗体评估的需求。
关键词：CHO；稳定细胞株；重组表达 库要摘文论士硕博学大门厦 VI Abstract Abstract AlargeamountofantibodiesareneededsinceourlabhaveacquirednumerouspharmaceuticalantibodiesagainstvirusessuchasHepatitisBvirus,Humanrespiratorysyncytialvirusandinfluenzavirus.Whileproteinsexpressedbytransientexpressionarealwaysdifferentinbatchcultures,thereisaneedforstablecellstoprovideconsistentlystableproductstotheglobalmarket. 库TheaimofthedissertationprojectistoconstructengineeredCHOcelllinesfor stableandhighproductionofbinantproteins.WehavealreadyacquiredCHO-
S, 要CHODG44,CHOK1ascandidatehostcells.CHO-Sissuspendedanditisa摘widely-usedhostcelllineinbinantproteinexpression.Cellswerescreened withtheincreasingconcentrationsofpuromycinandmethotrexate.Thestudyfocused 文onthefastgenerationofhigh-productiveCHOcelllines.Previously,morethan6论monthswereneededbeforewegotthesuspendedcandidatecelllines.Afterchanging士thewayoftransfectionandoptimizingthescreeningflowchart,thecadidatecelllines couldbeachievedinapproximately15weeks. 硕TheselectionflowchartwasdemonstratedbyGFPandmCherryinsertedinthe博plasmidpNIDVD-GFP&mCherry.Puromycinandmethotrexatewereactingon selectionmarkersPacanddhfrintheplasmid,respectively.Theresultsdescribeda 学factthataddingbothpuromycinandMTXcouldenhancetheexpressionefficiencyof大binantproteins. Electroporationwasusedasthetransfectionmethodinsteadoftraditional 门transfectionmethod,PEI,andafteroptimization,thetransfectionefficiencycould厦arriveat80.27%forCHO-Scellsandthatwassufficientmercialproduction, whichboosttheefficiencyofselectingcelllines.Forproteinproduction,wechoseapharmaceuticalhumanizedantibody, E6F6hAb-162,againstHBV,andproteinsproducedbythesecelllinesweretobeanalysedinpreclinicalstudy.Finallyweobtained4highlyexpressedcelllinesandtheyieldwasupto225.12mg/L.Thestudywillcontributetofurtherstudyofstablecelllinesandthelarge-scalecellcultureinbinantproteinexpressionindustry. VII Abstract Overall,thisstudyhasconstructedanovelmethodoffastgenerationofhighlyefficientCHOcelllines,whichshorten1/3oftheconstructionparingtothetraditionalmethod.Keywords：CHO；Stablecellline；binantproteinexpression 库要摘文论士硕博学大门厦 VIII 缩略词（Abbreviation） 缩略词(Abbreviation) 缩写 英文名称 中文名称 FDA FoodandDrugAdministration 食品药品监督管理局 CFDA ChinaFoodandDrugAdministration国家食品药品监督管理总局 HBV 库mAb hAb 要Ig摘HAMA PCR 文ELISA士论HRP HBsAg 硕CHO-S博FBS DMSO 学PEI大GFP P-F68 门SFM厦H&
T HepatitisBVirus Monoclonalantibody Humanizedantibody Immunoglobulin HumanAnti-mouseAntibody PolymeraseChainReaction Enzyme-linked Immunosorbent Assay Horseradishperoxidase HepatitisBSurfaceAntigen ChineseHamsterOvary(Suspension) Fetalbovineserum DimethylSulfoxide Polyethylenimine GreenFluorescentProtein PluronicF-68 Serum-freeMedium Hypoxanthine&Thymidine 乙型肝炎病毒单克隆抗体人源化抗体免疫球蛋白人抗鼠抗体聚合酶链式反应酶联免疫吸附测定 辣根过氧化物酶乙肝表面抗原中国仓鼠卵巢细胞（悬浮）胎牛血清二甲基亚砜聚乙烯亚胺绿色荧光蛋白嵌段式聚醚F-68无血清培养基次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷 VCD ViableCellDensity 活细胞密度 MTX Methotrexate 甲氨蝶呤 DHFR DihydrofolateReductase 二氢叶酸还原酶 GS GlutamineSynthetase 谷氨酰胺合成酶 PGK PhosphoglycerateKinase 磷酸甘油酸酯激酶 IX CMVpAORFPac 缩略词（Abbreviation） CytomegalovirusPolyadenylationOpenReadingFramePuromycinResistanceGene 巨细胞病毒多聚腺苷酸尾开放阅读框嘌呤霉素抗性基因 库要摘文论士硕博学大门厦
X 第一章前言 第一章前言 抗体（antibody）是机体免疫系统在抗原（antigen）刺激下产生的可以和相应抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin）。
由于抗体与抗原特异性结合的特性，抗体可在体内发挥预防与治疗疾病的作用。
与低分子量的化学药物相比，抗体药物半衰期更长、毒性更低、特异性更好，而且由于其自身生物大分子 库性质难以仿制，因此迅速发展成为近年来国际医药产业最受瞩目、潜力最大、盈 利最强的领域之
一。
摘要1抗体药物的发展与现状文单克隆抗体（monoclonalantibody，简称mAb）具有结构均
一、特异性强、 效价高等优点，在疾病的预防、诊断及治疗中具有广泛的应用：
（1）单抗药物偶 论联物对肿瘤细胞有明显的选择性杀伤作用，对抗原表达细胞的作用较强，而对抗士原性无关的细胞作用很弱。
这种选择性杀伤作用有效在作用于肿瘤细胞的同时保硕护体内正常细胞不受伤害；
（2）单抗药物疗效更高。
与相应的游离药物相比，抗 体药物偶联物具有更高的疗效和更低的毒性。
研究表明单抗药物在体内呈特异性 博分布，在肿瘤部位浓度更高；
（3）单抗药物对耐药性肿瘤细胞仍能表现出显著杀学伤作用。
对于长期用某一药物而出现抗药性的肿瘤细胞，使用其抗体药物偶联物 仍可表现较强的杀伤作用[1]。
大1.1抗体药物发展历程厦门德国科学家PaulEhrlich在19世纪提出了关于药物选择性作用于病变器官的 假说，并对其进行实践并且应用于梅毒治疗。
由于这项工作，PaulEhrlich在1908年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
1880年，德国医学家EmilAdolfvonBehring等人发现毒素免疫过的动物血清可有效治疗该毒素导致的人类疾病，由此提出了血清疗法。
随后，含抗体血清被广泛用于病毒和细菌性疾病的治疗。
这些血清就是第一代抗体药物，它们虽然表现出一定的疗效，但是异源蛋白会引起强烈的人体免疫反应，毒副作用极大。
因此第一代抗体药物的应用受到了限制。

1 第一章前言 1975年，剑桥大学的esKöhler和CésarMilstein成功将骨髓瘤细胞与B细胞融合。
这种杂交瘤细胞具有永生化的特征，可以不断生产出具有抗原特异性并且性质相同的单克隆抗体（monoclonalantibody）[2]。
这种杂交瘤细胞生产的单克隆抗体作为第二代抗体药物迅速应用于研究和临床实验。
1986年，美国FDA批准可用于器官移植时排异反应的抗CD3单抗OKT3进入市场。
然而鼠单抗在人体内反复应用会引起人抗鼠抗体反应（humananti-mouseantibody，HAMA），导致药物疗效的降低，并引起过敏反应，因此并未表现出理想的治疗 库效果[3]。
随着基因工程技术的快速发展，第三代抗体药物——嵌合抗体、人源化抗体 要以及全人源抗体逐渐用于临床治疗。
1988年，剑桥大学的GregWinter带领团队摘创立了人源化抗体技术[4]。
人源化抗体技术是利用DNA重组技术分别将抗体的 轻链与重链可变区基因插入带有人抗体恒定区的载体中[5]，随即表达出人-鼠嵌 文合抗体。
嵌合抗体的人源化程度约为70%，然而保留的30%鼠源性仍可诱发论HAMA反应，因此可对嵌合抗体进行人源化改造[5]。
最常见的人源化改造方式是士将编码鼠单抗CDR（Complementarity－DeterminingRegions）的核酸序列重组克 隆到人单抗的恒定区，最大程度降低鼠单抗的免疫原性。
相比于嵌合抗体，人源 硕化抗体进一步减少了鼠源部分的比例，降低HAMA反应。
博表1.1人源化抗体与全人源抗体制备方法优缺点比较[6] 学Table1.1Comparisonofwaysconstructinghumanizedantibodyandhuman厦门大antibody 虽然人源化抗体中鼠源部分的比例明显减少，但是人源化抗体的免疫原性并
2 Degreepapersareinthe“XiamenUniversityElectronicThesesand DissertationsDatabase”. 库Fulltextsareavailableinthefollowingways:要
1.IfyourlibraryisaCALISmemberlibraries,pleaselogon /andsubmitrequestsonline,orconsulttheinterlibrary 摘loandepartmentinyourlibrary.文
2.Forusersofnon-CALISmemberlibraries,pleasemailtoetd@厦门大学博硕士论fordeliverydetails.