研究工具 beINSPIREDdriveDISCOVERYstayGENUINE beINSPIREDdriveDISCOVERYstayGENUINE 基因编辑：CRISPR/Cas研究工具 基因编辑是用来对活细胞基因组进行精准的靶向改造的工具。
近期使用的两种靶向基因修饰方法，如：锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs），虽然都能够通过引入双链DNA断裂激活修复途径，实现突变，但是这些方法对于研究者来说既昂贵又耗时，限制了它们的广泛使用，尤其是对于大规模、高通量的研究。
最近，基于酿脓链球菌（uspyogenes）CRISPR相关蛋白-9核酸酶（Cas9）的基因编辑方法引起了学术界的极大兴趣。
近年随着CRISPR/Cas9技术的兴起，基因编辑领域掀起了一股新的研究热潮。
CRISPR（规律性间隔的短回文序列重复簇）/Cas（CRISPR相关蛋白）是细菌和古细菌获得性免疫所必需的，用以抵御和清除入侵的异己遗传物质。
体内CRISPR/Cas过程：细菌获得性免疫 ForeignDNA AcquisitionBacterialgenome crRNAbiogenesis InterferenceForeignDNA TargetPAMCRISPRlocus casgenescrRNA crRNA crRNA PrimarytranscriptcrRNA Cleavage Casnuclease 获得性免疫初期，外源DNA被整合到细菌基因组中的CRISPR位点。
CRISPR位点在crRNA生物合成过程中转录成crRNA。
在干扰期间，Cas核酸内切酶与crRNA结合，切割含有与PAM序列相邻的crRNA互补序列的外源DNA。
（图未按比例绘制）。

2 CRISPR/CAS9基因组编辑 CRISPR/Cas基因组编辑 CRISPR核酸酶系统（核酸酶和向导RNA）的简单性，使该系统具有良好的实验室应用价值。
基因组断裂处通过容易出现错配的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向重组（HDR）两种方式来激活修复过程。
在提供有与目标基因座同源的供体模板的情况下，HDR途径被激活，实现精准突变。
在没有模板的情况下，NHEJ被激活，导致插入或缺失（indels），从而改造目标区域（2,3）。
工具&资源 浏览/GenomeEditing了解更多有关基因编辑应用的产品列表和操作指导。
CasRNP复合物的直接导入 直接导入Cas9/向导RNA复合物（4-9）或Cas12a(Cpf1)/向导RNA复合物是进行基因编辑的最高效方法。
该方法简化了CRISPR/Cas研究的实验流程且被报道能提高诱变活性（4-6）、降低脱靶效应（4,5）。
NEB为直接采用CasRNP复合物方法的客户提供纯度很高的带有核定位序列的Cas9核酸酶和Cas12a核酸酶（Cpf1）（NEB#M0654,NEB#M0646,NEB#M0653）。
订购信息 产品信息Cas9Nuclease,S.pyogenesEnGenCas9Nuclease,NLS,S.pyogenesEnGenSpyCas9NickaseEnGenSpydCas9(SNAP-tag®)EnGenLbaCas12a(Cpfl)EnGenSauCas9 货号M0386S/T/MM0646T/MM0650S/TM0652S/TM0653S/TM0654S/T 使用Cas9RNP复合物注射方法提高了基因组编辑效率 %modification 100 80 60 40 20 0Untransfected PlasmidDNA mRNA Cas9 EnGenCas9NLS 将打靶特定人源基因的Cas9和sgRNA转染到HEK293细胞。
转染所用的质粒DNA上含有表达带双端核定位序列（NLS）的Cas9及sgRNA的表达框，通过TransIT-X2(Mirus)转染试剂进行转染。
转染所用的Cas9mRNA进行了假尿苷和5-甲基胞嘧啶修饰且带有双端核定位序列，使用transIT-mRNA转染试剂将sgRNA和mRNA共转染。
Cas9RNPs使用脂质体RNAiMAX(LifeTechnologies)进行反向转染，RNP的终浓度为10nmol。
Cas9蛋白上不含核定位序列。
EnGenCas9含有双端核定位序列。
编辑效率通过T7E1实验进行分析，结果以修饰百分比进行统计。
克隆自酿脓链球菌的Cas9核酸酶（A）和克隆自稻蝗科细菌N2006的LbaCas12a（B）的序列识别和DNA切割示意图 A 5´3´ DNA sgRNA PAM(NGG) 3´5´ TargetDNA 3´ GAGAACGGCGAAAACTAACT GAGAACGGCGAAAACUAACUCTCTTGCCGCTTTTGATTGA TGGACC Cleavage Cas9Nuclease,S.pyogenes
B gRNA PAM(TTTN) 5´ GAGAAGTCATCTAATAAGGCCACT 5´3´ DNA TTTCGAGAAGUCAUCUAAUAAGGC 3´ AAAGCTCTTCAGTAGATTATTCCGGTGA 5´ TargetDNA Cleavage Cas12aNuclease,LachnospiraceaebacteriumN2006
3 CAS9/sgRNA生成&导入 与SpyCas9联合使用的sgRNA模板的快速合成 EnGensgRNA合成试剂盒可以进行模板合成与转录，在一个小时或更短的时间内转录毫克级别的sgRNA。
单管反应，操作简便，仅需将单条~55nt的ssDNA靶标特异性寡核苷酸模板与试剂盒里的反应预混液和酶预混液混合即可完成反应。
转录的sgRNA适合多种下游应用，如：CRISPR/Cas9基因编辑、体外DNA切割等。
单管反应易于操作且减少了DNA扩增和纯化步骤。
该试剂盒与EnGenSpyCas9NLS，Cas9Nuclease，EnGenSpyCas9Nickase和EnGenSpydCas9(SNAP-tag)均可兼容使用。
EnGensgRNA合成试剂盒概览 订购信息 产品信息EnGensgRNASynthesisKit 货号E3322S Needhelpconfiguringtarget-specificDNAoligos?
sgRNA靶向序列可以通过EnGensgRNATemplateOligoDesigner进行设计，登陆了解更多详情。
A.5´ Target-specificoligo 3´ T7promoter Target-specificOverlapsequence Single-tubereaction(37°C,30min.) Addatroomtemperature:•2XsgRNAReactionMix (containsscaffoldoligo)•sgRNAEnzymeMix B.5´ C.5´ 3´
D. 3´ 5´Target-specificsequence 3´DNAextension TranscriptionTarget-specificsgRNA 5´S.pyogenesCas9 scaffoldoligo 3´5´dsDNAtemplate 3´ ThiskitisreallyeasytouseandwillsaveusplentyoftimeinmakingsgRNAs!
Thanksforthestreamlinedmethod!
–PostdoctoralResearcher,HarvardUniversity
A.目标特异性序列包括T7启动子序列、~20nt目标基因序列和与Cas9支架区寡核苷酸互补的14nt重叠序列（包含在反应预混液里）。
室温下将目标特异性序列与EnGen2XsgRNA反应预混液、EnGensgRNA酶预混液进行混合。
B.37℃下，14nt重叠互补序列退火
C.DNA聚合酶在3’端开始延伸形成双链DNA模板
D.RNA聚合酶识别T7启动子、启动转录，完成目标特异性sgRNA的转录。
所有反应单管进行，37℃孵育30分钟。
词汇表 新技术衍生新词汇，CRISPR/Cas9基因编辑首字母缩略词和缩略语一览表 Cas=CRISPR-associatedgenesCas9,Cas12a=aCRISPR-associatedproteinthatisprogrammedbysmallRNAstocleaveDNAcrRNA=CRISPRRNAdCAS9=nuclease-deficientCas9DSB=Double-StrandedBreakgRNA=guideRNAHDR=Homology-DirectedRepairHNH=anendonucleasedomainnamedforcharacteristichistidineandasparagineresidues Indel=Insertionand/ordeletionNHEJ=Non-HomologousEndJoiningPAM=Protospacer-AdjacentMotifRNP=ribonucleoproteinRuvC=anendonucleasedomainnamedforanE.coliproteininvolvedinDNArepairsgRNA=singleguideRNAtracrRNA=trans-activatingcrRNATALEN=Transcription-ActivatorLikeEffectorNucleaseZFN=Zinc-FingerNuclease
4 编辑效率&基因编辑产品 编辑效率检测：EnGen突变检测试剂盒和T7核酸内切酶
I 广泛使用的鉴定突变的方法是T7核酸内切酶I突变检测分析（10，11）。
该分析可检测由DNA双链退火产生的含特定突变的DNA链及野生型DNA链组成的异源杂交双链。
EnGen突变检测试剂盒利用T7核酸内切酶I对编辑效率进行鉴定，试剂盒内包含检测所需的优化试剂。
EnGen突变检测试剂盒工作流程示意图 IsolationofGenomicDNA FragmentAnalysis Targetedcells Modiedlocus 订购信息 产品信息EnGen突变检测试剂盒T7核酸内切酶I（T7EI）Q5®HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix 货号E3321SM0302S/L M0494S/L Needtodeterminetargetingefficienciesover50%?
评估编辑效率可通过/Cas9locusmod来进行。
RFU PCRAmplication Denaturation&AnnealingPossiblere-annealingproducts DigestionofMismatchedDuplexesT7EndonucleaseI Calculatefrequencyusingpeakheights Gel-basedSeparation bp10380 500020001000700500300 50
L 1
2 用靶向引物对基因编辑修饰的基因组进行扩增。
PCR产物经变性和再退火产生三种不同的扩增产物。
用T7核酸内切酶I消化PCR产物中含错配碱基的DNA双链，然后电泳分离DNA，并进行片段分析以评估编辑效率。
设计同源修复模板 在反应体系中额外添加同源修复模板可以对Cas9编辑位点进行靶向修饰。
同源修复模板可以是质粒或寡核苷酸，其内含有目标序列附近同源区及想引入的突变序列。
质粒可用于“knock-in”筛选标记或荧光标签等大片段插入序列。
构建质粒时可用高保真聚合酶扩增基因组上目标区域附近的同源序列，然后克隆到质粒骨架中。
NEB推荐使用Q5高保真DNA聚合酶扩增同源序列，然后用NEBPCRCloningKit进行后续克隆。
对质粒的进一步改造可以使用NEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMix进行快速质粒克隆组装或Q5Site-DirectedMutagenesisKit进行位点特异性突变来实现。
订购信息 产品信息 Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMixNEBPCRCloningKitNEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMixNEBuilderHiFiDNAAssemblyCloningKitQ5Site-DirectedMutagenesisKitQ5Site-DirectedMutagenesisKit(withoutCompetentCells) 货号 M0494S/LE1202S（中国大陆暂不销售）E2621S/L/XE5520S（中国大陆暂不销售）E0554S（中国大陆暂不销售）E0552S
5 sgRNA模板制备 CRISPR/Cas基因编辑sgRNA模板制备 Cas9实验中除了Cas9酶外，还需要引入向导RNAs。
sgRNAs包含20个碱基序列，位于固定的支架序列上游，与目标序列特异互补。
sgRNA可以通过体外合成获得，也可以通过表达质粒转录生成。
无论研究者选用哪种方式获得sgRNA，NEB都可以提供针对不同20-bpsgRNA模板生成策略的工具。

1 BbsIENZYME-BASEDSTRATEGY ~20bases 3´ Annealing 5´ 5´3´ DigestionwithBbsI 5´3´3´5´ sgRNAexpression vector Phosphorylation&ligation(T4PNK&T4DNALigase) TargetDNAsequencetracrRNAsequencePromoter Assembledvector
2 Q5®SITE-DIRECTEDMUTAGENESISSTRATEGY Amplification ~20baseinsertion Primer sgRNAexpression vector High-fidelity PCR 3´ 5´ Treatment5´withKLDMix3´
3 NEBUILDER®HIFIDNAASSEMBLYSTRATEGY ~25bases ~25bases Annealing5´ ~20bases +5´ 3´ 3´5´ Singlesynthetic3´oligonucleotides Linearizationwithrestrictionenzyme sgRNAexpression vector NEBuilderHiFiDNAAssembly Assembledvector Assembledvector Transformation&Purification Invitrotranscription sgRNAplasmid + Cas9plasmid sgRNA + Cas9mRNA sgRNA + + Cas9protein Homologousrepairtemplate(optional) Cells Animals Invitro
6 订购信息 产品信息BbsIT4DNALigaseT4PolynucleotideKinase 货号R0539S/LM0202S/T/L/MM0201S/L 产品信息 Q5Site-DirectedMutagenesisKitQ5Site-DirectedMutagenesisKit(WithoutCompetentCells) 货号E0554S （中国大陆暂不销售） E0552S 产品信息 Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix NEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMix NEBuilderHiFiDNAAssemblyCloningKit 货号 M0494S/L E2621S/L/XE5520S （中国大陆暂不销售） 产品信息 EnGensgRNASynthesisKit NEB5-alphaCompetentE.coli(HighEfficiency) NEB10-betaCompetentE.coli(HighEfficiency) HiScribe™T7ARCAmRNAKit HiScribeT7ARCAmRNAKit(withtailing) HiScribeT7HighYieldRNASynthesisKit HiScribeT7QuickHighYieldRNASynthesisKit RNACapStructureAnalog3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G iniaCappingSystem MonarchRNACleanupKit 货号E3322SC2987P/R/I/H/U （中国大陆暂不销售） C3019I/H （中国大陆暂不销售） E2065S E2060S E2040S E2050S S1411S/LM2080ST2040S/L 设计同源修复模板 NEB特色CRISPR产品集锦 产品名称EnGenCas9NucleaseNLS,S.pyogenesEnGenMutationDetectionKitEnGensgRNASynthesisKitEnGenSpyCas9NickaseEnGenSpydCas9(SNAP-tag®) EnGenLbaCas12a(Cpfl) Cas9Nuclease,S.pyogenesQ5Site-directedMutagenesisKit(withorpetentcells)Q5High-fidelityDNAPolymerasesNEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMixNEBuilderHiFiDNAAssemblyCloningKitHiScribeT7ARCAmRNAKit(withorwithouttailing)HiScribeT7HighYieldRNASynthesisKitHiScribeT7QuickHighYieldRNASynthesisKitT7EndonucleaseI NEWEnGenSauCas9 MonarchRNACleanupKit *浏览查找订购信息。
**标示的货号在中国大陆暂不销售。
CRISPC/CAS9应用体外切割dsDNA。
直接导入活性核酸酶复合物进行基因编辑。
基因编辑效率检测毫克级别的特异性sgRNA制备体外切刻dsDNA。
直接导入活性核酸酶复合物进行基因编辑。
体外结合DNA。
与SNAP标记底物合用，易于可视化和富集。
体外切割dsDNA。
直接导入活性核酸酶复合物进行基因编辑。
识别5'-TTTNPAM序列。
体外切刻dsDNA。
直接导入活性核酸酶复合物进行基因编辑。
CAS9-sgRNA构建子的靶序列插入及HDR模板修饰 高保真扩增目的序列单管、等温合成基因编辑质粒及HDR模板单管、等温合成基因编辑质粒及HDR模板制备带ARCA帽的Cas9mRNA制备sgRNA和Cas9mRNA制备sgRNA和Cas9mRNA基因编辑效率检测体外切割dsDNA。
直接导入活性核酸酶复合物进行基因编辑。
sgRNA和Cas9mRNA纯化 参考资料
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forum/crispr 生物特异性••fl 浏览:sgRNA合成和sgRNA/Cas9复合物直接导入受体的应用方案 EnGensgRNATemplateOligoDesigner设计sgRNA（） NEBuilder®用于DNA组装() NEBaseChanger®用于Q5Site-DirectedMutagenesisKit设计()
7 NEB（北京）客服及技术支持客服电话：400-811-2220/400-690-3366电话：010-82378266传真：010-82378262e-mail：support@网址：官方微信：NEBiolabs 美国NewEnglandBiolabs,Inc.Telephone(978)927-5054TollFree(USAOrders)1-800-632-5227TollFree(USATech)1-800-632-7799Fax(978)921-1350info@ 澳大利亚NewEnglandBiolabs(Australia)PTYTelephone+61(1800)934218Email:info.au@ 加拿大NewEnglandBiolabs,Ltd.TollFree:1-800-387-1095info.ca@ 法国NewEnglandBiolabsFranceTelephone:0800100632info.fr@ 德国/奥地利NewEnglandBiolabsGmbHFreeCall:0800/2465227(Germany)FreeCall:00800/24652277(Austria)info.de@ 日本NewEnglandBiolabsJapan,Inc.Telephone:+81(0)356696191info.jp@ 新加坡NewEnglandBiolabs,PTE.Ltd.Telephone+6567760903sales.sg@ 英国NewEnglandBiolabs(UK),Ltd.CallFree:0800318486info.uk@ ISO9001Registered QualityManagement ISO14001Registered EnvironmentalManagement ISO13485Registered MedicalDevices NEB完美品质成就科学梦想 NEB（北京）100083北京海淀区王庄路1号清华同方科技广场B座0612客服热线:400-811-2220/400-690-3366电话:010-82378266传真:010-82378262网站:邮箱:support@ NEB官方微信：NEBiolabs NEB官方微信 特色线上工具 设计靶标特异性DNA寡核苷酸序列，请使用EnGensgRNATemplateOligoDesigner在线工具（） 设计DNA克隆组装引物，请使用NEBuilder®DNAAssemblyTool() 下载适用于iPhone®或iPad®的NEBAR应用。
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