ScientificGeneJET质粒大提试剂盒
#K0491,#K0492
/onebio
1 #K0491,#K0492批号有效期 分析证书 根据本说明书提供的方法，使用ThermoScientificGeneJET质粒中提试剂盒从250mL过夜培养的大肠杆菌E.coliLB培养物（OD600=2）中分离高拷贝的质粒DNA。
当所纯化DNA的A260/280比值在1.8-1.9之间，且通过琼脂糖凝胶电泳检测到超螺旋质粒DNA的条带，该试剂盒才能通过QC的要求。
纯化DNA的功能质量以限制性酶切的方法评估。
质量授权人： Jurgita
7 方法A：低速离心法纯化质粒DNA..............................................................................7方法B：高速离心法纯化质粒DNA..............................................................................8方法C：真空法纯化质粒DNA......................................................................................9
3 试剂盒组分 GeneJET质粒大提试剂盒 重悬液裂解液中和液内毒素结合液漂洗液Ⅰ（浓缩）漂洗液Ⅱ（浓缩）RNaseA溶液洗脱液（10mMTris-HCl,pH8.5）GeneJET质粒大提纯化柱，预装入收集管中（50mL）收集管（50mL） #K049110preps72mL72mL72mL9.6mL75mL75mL3×1.0mL18mL 10 10 #K049125preps180mL180mL180mL24mL180mL180mL6×1.2mL45mL 25 25 贮存和稳定性 将内毒素结合液存储于4℃，,试剂盒其它组分在室温下（15-25℃）贮存。
RNaseA溶液未打开时，在室温下是稳定的。
一旦打开后，请将其贮存于-20℃。
重悬液中加入RNaseA后，应将重悬液于4℃保存，可保存6个月。
为了更长时间的储存，推荐将纯化柱储存于4℃。
注：每次使用后，请紧密封闭装有GeneJET中提纯化柱的包装袋！若贮存过程中缓冲液里出现沉淀物质，使用前需在37℃条件下重新溶解，冷却至室温后再使用。
产品介绍 GeneJET质粒大提试剂盒旨在从重组大肠杆菌E.coli中大规模的提取高质量的质粒DNA。
试剂盒使用基于硅膜技术的离心柱。
每个GeneJET离心柱可回收多达750µg高拷贝质粒DNA。
纯化的质粒DNA可以广泛应用于下游各种分子生物学实验，如限制性内切酶酶切、PCR、克隆、转化、自动测序、体外转录和强健细胞系的转染。
基本原理 收集的细菌细胞经过重悬，加入SDS碱性裂解液后，释放出质粒DNA。
中和得到的裂解液，使得变性的质粒DNA重新退火，而细胞残留物，如蛋白、染色质DNA和SDS沉淀物析出溶液。
通过离心除去细胞碎片和SDS沉淀物。
将含有质粒DNA的上清加入离心柱。
裂解液中的高盐浓度为质粒DNA结合于离心柱硅膜提供了合适的条件，吸附于膜上的DNA通过漂洗以除去污染物，之后通过洗脱缓冲液将其洗脱出来。
4 重要事项 缓冲液准备 将随试剂盒提供的RNaseA溶液加入重悬液，混合均匀。
加入RNaseA后，重悬液可在4℃条件下保存6个月。
如果不经常使用试剂盒，将重悬液进行分装。
分装后向其中一个分包装中按照1mL重悬液中加入40µlRNaseA的比例加入RNaseA，得到工作溶液。
将剩余的RNaseA贮存于-20℃。
工作溶液也可以通过向分装的重悬液里加入RNaseA的方式来配制。
首次使用时，按照下面推荐的体积，向漂洗液Ⅰ（浓缩的）中加入异丙醇，向漂洗液Ⅱ（浓缩的）中加入无水乙醇（96-100％）： 浓缩的漂洗液异丙醇乙醇（96-100％）总体积 10preps（#K0491） 漂洗液Ⅰ 漂洗液Ⅱ 75mL 75mL 25mL - - 125mL 100mL 200mL 25preps（#K0492） 漂洗液Ⅰ 漂洗液Ⅱ 180mL 180mL 60mL - - 300mL 240mL 480mL 每次使用前检查裂解液和中和液是否发生盐析。
若出现盐沉淀，请在37℃下重新溶解，冷却至25℃时再使用。
注意不要剧烈摇晃裂解液。
裂解液和漂洗液Ⅰ含有刺激性物质，当接触皮肤或吸入吞食对人体有害（见第13页安全信息），使用时请戴上手套。
所需额外试剂和仪器 移液器和枪头涡旋仪转速可达到~20000rpm（~48000×g）的离心机，且转头大小适合离心管转速可达到2000~5000×g的水平转头离心机真空管（用于真空法提取）一次性手套乙醇（96-100％）异丙醇 菌株 从各种大肠杆菌E.coli菌株（包括DH10B、DH5α、XL1-Blue、JM109、JM107、TOP10）均可提取获得高质量的质粒DNA。
培养基 本手册中提供的GeneJET质粒大提方案适于使用LB培养基进行细菌培养，至细菌浓度约为2-3（OD600=2-3）。
不推荐使用富营养生长培养基。
5 细菌培养 从划线平板上挑取单克隆，培养于含相应抗性的1-5mLLB培养基中。
在37℃、200-250rpm摇床中培养约8小时。
将起始培养物用LB培养基按1：1000到1:10000的比例进行稀释，在37℃、200-250rpm摇床中培养12-16小时（过夜）。
用于质粒DNA提取的细菌培养物推荐浓度为2-3（OD600=2-3）。
将细菌培养物离心（5000×g）10分钟以收集菌体，去除上清。
收集的菌体可直接使用或贮存于-20℃。
培养体积 一般来说，250mL过夜培养的细菌LB培养物足够提取出高产量的高拷贝或低拷贝质粒DNA。
但是，请注意不要超过推荐的细菌细胞量（培养物体积×OD600），可能会造成所分离DNA的质量下降。
使用细菌培养物的最大体积可以按如下公式进行计算： 最大培养物体积（V），mL=750/OD600 表1各种质粒的拷贝数高拷贝300-700拷贝每细胞pUCvectorspBluescriptvectorspGEMvectorspTZvectorspJETvectors 低拷贝10-50拷贝每细胞pBR322andderivativespACYCandderivatives 极低拷贝最多5拷贝每细胞pSC101andderivatives
6 提纯方法 GeneJET质粒大提试剂盒提供三种用于质粒DNA提纯的优化方案：低速离心法（5000×g）、高速离心法（48000×g）和真空提取法。
方法
A.低速离心法纯化质粒DNA 步骤1 2 345678 9101112 过程按照第6页的说明，培养250mL细菌培养物至其OD600为2~
3。
为了得到更好的结果，请参照第6页的“培养体积”计算出所需培养物的最大体积。
离心（5000×g，10分钟）收集菌体细胞，弃掉上清。
将收集的菌体细胞重悬于6mL重悬液中。
通过涡旋或者移液器吹吸重悬菌体细胞，直至无残留菌块。
注：确保重悬液中已加入RNaseA溶液。
加入6mL裂解液，轻柔颠倒反应管4-6次将其混匀，直至溶液变得黏稠清亮。
室温条件下孵育3分钟。
注：请勿涡旋混匀，避免染色质DNA断裂。
孵育时间不要超过3分钟，以避免超螺旋质粒DNA的变性。
加入6mL的中和液，立即颠倒反应管5-8次以混合均匀。
加入0.8mL内毒素结合液，立即颠倒反应管5-8次以混合均匀。
室温孵育5分钟。
注：加入中和液和内毒素结合液后，请注意将其轻柔混匀，以避免细菌细胞碎片的局部沉淀。
中和后的细菌裂解液浑浊且含有白色沉淀。
加入6mL96％乙醇，立即颠倒反应管5-6次进行混匀。
离心（4000-5000×g，40分钟）以沉淀细胞碎片和染色质DNA。
（如果需要，参看第9页继续采用真空法提取）注：请使用推荐的离心速度。
将上清转移至50mL反应管（未提供）中，避免转移白色沉淀或使其浑浊。
加入6mL96％乙醇，立即颠倒反应管5-6次进行混匀。
将部分上清（~20mL）转移至试剂盒提供的纯化柱中。
请注意不要将纯化柱加样过满。
使用水平转头2000×g离心3分钟。
弃掉流穿液，将纯化柱放回同一收集管中。
注：使用后请封闭装有纯化柱的包装袋!
重复步骤9将剩余的上清经纯化柱处理。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅰ（按照第5页的描述用异丙醇进行稀释）。
使用水平转头3000×g离心2分钟。
弃掉流穿液，将纯化柱放回同一收集管中。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅱ（按照第5页的描述用异丙醇进行稀释）。
使用水平转头3000×g离心2分钟。
弃掉流穿液，将纯化柱放回同一收集管中。
7 13 使用漂洗液Ⅱ重复清洗一次纯化柱（步骤12）。
使用水平转头3000×g离心5分钟以除去残留的漂洗液，弃掉含有 14 流穿液的收集管。
将纯化柱转移至新的50mL收集管中（已提供）。
向纯化柱膜中心 加入1mL洗脱缓冲液。
室温孵育2分钟，使用水平转头3000×g 离心5分钟以洗脱质粒DNA。
注：为了增加所洗脱DNA的浓度，洗脱缓冲液的体积可减少至0.7 15 mL。
但需要注意的是，洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱DNA 的产量。
若使用洗脱缓冲液（0.5mL）再次进行洗脱（可选），DNA的总回 收率可提高20-30％。
·6弃掉纯化柱。
将纯化的质粒DNA用于下游实验或贮存于-20℃。
方法
B.高速离心法纯化质粒DNA 步骤12345 67 过程 按照第6页的说明，培养250mL细菌培养物至其OD600为2~
3。
为了得到更好的结果，请参照第6页的“培养体积”计算出所需培养物的最大体积。
离心（5000×g，10分钟）收集菌体细胞，弃掉上清。
将收集的菌体细胞重悬于6mL重悬液中。
通过涡旋或者移液器吹吸重悬菌体细胞，直至无残留菌块。
注：如第3页的描述，确保重悬液中已加入RNaseA溶液。
加入6mL裂解液，轻柔颠倒反应管4-6次将其混匀，直至溶液变得黏稠清亮。
室温条件下孵育3分钟。
注：请勿涡旋混匀，避免染色质DNA断裂。
孵育时间不要超过3分钟，以避免超螺旋质粒DNA的变性。
加入6mL的中和液，立即颠倒反应管5-8次以混合均匀。
加入0.8mL内毒素结合液，立即颠倒反应管5-8次以混合均匀。
室温孵育5分钟。
注：加入中和液和内毒素结合液后，请注意将其轻柔混匀，以避免细菌细胞碎片的局部沉淀。
中和后的细菌裂解液浑浊且含有白色沉淀。
离心（20000rpm/48000×g，20分钟）以沉淀细胞碎片和染色质DNA。
（如果需要，参看第8页继续采用真空法提取）注：请使用推荐的离心速度。
将上清转移至50mL反应管（未提供）中，避免转移白色沉淀或使其浑浊。
加入1体积的96％乙醇，立即颠倒反应管5-6次进行混匀。
8 将部分上清（~20mL）转移至试剂盒提供的纯化柱中。
请注意不要 将纯化柱加样过满。
使用水平转头2000×g离心3分钟。
弃掉流穿
8 液，将纯化柱放回同一收集管中。
注：使用后请封闭装有纯化柱的包装袋!
9 重复步骤8将剩余的上清经纯化柱处理。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅰ（按照第5页的描述用异丙醇进行 10 稀释）。
使用水平转头3000×g离心2分钟。
弃掉流穿液，将纯化 柱放回同一收集管中。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅱ（按照第5页的描述用异丙醇进行 11 稀释）。
使用水平转头3000×g离心2分钟。
弃掉流穿液，将纯化 柱放回同一收集管中。
12 使用漂洗液Ⅱ重复清洗一次纯化柱（步骤11）。
使用水平转头3000×g离心5分钟以除去残留的漂洗液，弃掉含有 13 流穿液的收集管。
将纯化柱转移至新的50mL收集管中（已提供）。
向纯化柱膜中心 加入1mL洗脱缓冲液。
室温孵育2分钟，使用水平转头3000×g 离心5分钟以洗脱质粒DNA。
注：为了增加所洗脱DNA的浓度，洗脱缓冲液的体积可减少至0.7 14 mL。
但需要注意的是，洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱DNA 的产量。
若使用洗脱缓冲液（0.5mL）再次进行洗脱（可选），DNA的总回 收率可提高20-30％。
15 弃掉纯化柱。
将纯化的质粒DNA用于下游实验或贮存于-20℃。
方法
C.真空法提取质粒DNA 步骤12 345
6 过程按照第7页方法A的步骤1-8或第8页方法B的步骤1-
7，进行细菌细胞收集、裂解和溶解产物澄清步骤。
按照供应商的说明书准备真空歧管。
将GeneJET质粒中提纯化柱放于歧管上。
将部分上清（~20mL）转移至纯化柱中。
请注意不要将纯化柱加样过满。
使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱。
待溶液完全流穿纯化柱后关闭真空。
注：使用后请封闭装有纯化柱的包装袋!
重复步骤
3，抽吸残留溶液。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅰ（按照第5页的描述用异丙醇进行稀释）。
使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱。
待溶液完全流穿纯化柱后关闭真空。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅱ（按照第5页的描述用异丙醇进行稀释）。
使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱。
待溶液完全流穿纯化柱后关闭真空。
9 7 使用漂洗液Ⅱ重复清洗一次纯化柱（步骤6）。
为了使纯化柱干燥，可用真空抽吸10分钟，或将纯化柱转移至
一 8 个新的50mL收集管（已提供）中，使用水平转头3000×g离心
5 分钟。
将纯化柱转移至新的50mL收集管中（已提供）。
向纯化柱膜中心 加入1mL洗脱缓冲液。
室温孵育2分钟，使用水平转头3000×g 离心5分钟以洗脱质粒DNA。
注：为了增加所洗脱DNA的浓度，洗脱缓冲液的体积可减少至0.7
9 mL。
但需要注意的是，洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱DNA 的产量。
若使用洗脱缓冲液（0.5mL）再次进行洗脱（可选），DNA的总回 收率可提高20-30％。
10 弃掉纯化柱。
将纯化的质粒DNA用于下游实验或贮存于-20℃。
10 问题 质粒产量低 A260/280未达标准基因组DNA污染RNA污染纯化的质粒中含有多余条带下游酶促反应被抑制体外转录反应产物很少或没有 问题解决方案 可能的原因及解决方案细菌细胞的不完全裂解。
裂解之前，收集的菌体必须充分重悬于重悬液中。
在加入裂解液之前不应看到菌块存在。
裂解液使用前应检查其是否出现盐沉淀。
若发现盐沉淀，将试剂加热至37℃以重新溶解盐沉淀，混合均匀并冷却至25℃后再使用。
不要使用超过推荐的最大菌液量，参照第6页的“培养体积”。
漂洗液Ⅰ中未加入异丙醇。
确保使用前向漂洗液Ⅰ中加入异丙醇。
参照第3页的说明准备漂洗液Ⅰ。
漂洗液Ⅱ中未加入乙醇。
确保使用前向漂洗液Ⅱ中加入乙醇。
参照第3页的说明准备漂洗液Ⅱ。
纯化过程中纯化柱堵塞。
减少每个纯化柱所处理的细菌培养物体积。
当向纯化柱中加入溶菌液时，避免将细胞碎片加入纯化柱中。
细菌培养体积未经优化。
使用下面的公式计算最大的细菌培养体积：最大培养体积（V），mL=750/OD600。
接种细菌太老。
准备新的起始培养物，将新分离的单个菌落在含抗生素的生长培养基中培养，按照第6页的“细菌培养”培养细菌。
离心速度不合适请确保在纯化过程中使用推荐的离心速度，严格按照提供的离心方案操作对于实验的成功非常重要。
质粒DNA未经有效纯化。
减少细菌培养体积，按照第6页“细菌培养”的推荐量。
在细菌裂解和中和步骤中，样本经剧烈涡旋或摇晃。
为了避免基因组DNA污染，轻柔颠倒离心管4-8次以将溶液混匀（步骤3和4）。
裂解细胞（步骤3）不要超过3分钟。
细菌在LB培养基中培养时间不要超过16小时。
可以使用T7聚合酶（#EP0081）除去所纯化DNA中残留的基因组DNA。
首次使用前，重悬液中未加入RNaseA。
参照第5页的说明，确保使用前向重悬液中加入RNaseA。
细菌裂解中质粒DNA变性。
相比于超螺旋DNA，变性质粒DNA迁移率较快。
变性质粒不适用于接下来的酶切操作，如限制性酶切。
为了避免质粒变性，裂解细胞（步骤3）不要超过3分钟。
纯化的质粒DNA中含有乙醇。
洗脱DNA前将纯化柱彻底干燥（离心法的第13步或真空法的第14步）。
纯化的质粒DNA中含有RNaseA。
如果纯化的质粒DNA用于体外转录，可使用GeneJETPCR纯化试剂盒（#K0701）或酚氯仿抽提方法重新纯化线性化的质粒DNA。
11 参考文献
1.BirnboimH.C.,andDoly,
J.(1979)ArapidalkalinelysisprocedureforscreeningbinantplasmidDNA.NucleicAcidsRes.7,1513-1522.2.Vogelstein,B.andGillespie,
D.(1979)PreparativeandanalyticalpurificationofDNAfromagarose.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76,615-619. 产品使用限制本产品的开发、设计及销售专供研究和体外试验使用。
本产品不得用于诊断试验或药物 开发，也不适合向人或动物注射。
了解本产品的材料安全数据表，请浏览/onebio。
©2012ThermoFisherScientific，版权所有。
所有商标均归ThermoFisherScientific公司 或其子公司所有。
12 安全信息 裂解液 C具有腐蚀性辨别危险的成分标签：氢氧化钠 风险术语R34安全术语S20S23S26S36/37/39S45S60 引起灼伤 使用时，不得进食，饮水请勿吸入气体/烟雾/蒸汽/喷雾若溅入眼睛，立即用大量清水冲洗，并寻求医生治疗穿戴适当的防护服、手套和眼睛/面保护发生事故时或感觉不适时，立即求医（可能时出示标签）该物质及其容器必须作为危险废物处置 中和液 Xi有刺激性辨别危险的成分标签：乙酸 风险术语 R36/38对眼睛和皮肤具有刺激性 安全术语 S23 请勿吸入气体/烟雾/蒸汽/喷雾 S26 若溅入眼睛，立即用大量清水冲洗，并寻求医生治疗 S37 戴适当手套 S45 发生事故时或感觉不适时，立即求医（可能时出示标签） S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置 漂洗液Ⅰ Xi
有害辨别危险的成分标签：盐酸胍 风险术语R22R36/38安全术语S23S26S36/37S60 吞食有害对眼睛和皮肤具有刺激性 请勿吸入气体/烟雾/蒸汽/喷雾若溅入眼睛，立即用大量清水冲洗，并寻求医生治疗穿戴适当的防护服和手套该物质及其容器必须作为危险废物处置 13
1 #K0491,#K0492批号有效期 分析证书 根据本说明书提供的方法，使用ThermoScientificGeneJET质粒中提试剂盒从250mL过夜培养的大肠杆菌E.coliLB培养物（OD600=2）中分离高拷贝的质粒DNA。
当所纯化DNA的A260/280比值在1.8-1.9之间，且通过琼脂糖凝胶电泳检测到超螺旋质粒DNA的条带，该试剂盒才能通过QC的要求。
纯化DNA的功能质量以限制性酶切的方法评估。
质量授权人： Jurgita
Zilinskiene
2
目录
页码
试剂盒组分................................................................................................................................
贮存和稳定性............................................................................................................................
4产品介绍....................................................................................................................................
4基本原理....................................................................................................................................
4重要提示....................................................................................................................................
5所需额外试剂和仪器................................................................................................................
5提纯方法....................................................................................................................................
7 方法A：低速离心法纯化质粒DNA..............................................................................7方法B：高速离心法纯化质粒DNA..............................................................................8方法C：真空法纯化质粒DNA......................................................................................9
问题解决方案..........................................................................................................................
11安全信息..................................................................................................................................
133 试剂盒组分 GeneJET质粒大提试剂盒 重悬液裂解液中和液内毒素结合液漂洗液Ⅰ（浓缩）漂洗液Ⅱ（浓缩）RNaseA溶液洗脱液（10mMTris-HCl,pH8.5）GeneJET质粒大提纯化柱，预装入收集管中（50mL）收集管（50mL） #K049110preps72mL72mL72mL9.6mL75mL75mL3×1.0mL18mL 10 10 #K049125preps180mL180mL180mL24mL180mL180mL6×1.2mL45mL 25 25 贮存和稳定性 将内毒素结合液存储于4℃，,试剂盒其它组分在室温下（15-25℃）贮存。
RNaseA溶液未打开时，在室温下是稳定的。
一旦打开后，请将其贮存于-20℃。
重悬液中加入RNaseA后，应将重悬液于4℃保存，可保存6个月。
为了更长时间的储存，推荐将纯化柱储存于4℃。
注：每次使用后，请紧密封闭装有GeneJET中提纯化柱的包装袋！若贮存过程中缓冲液里出现沉淀物质，使用前需在37℃条件下重新溶解，冷却至室温后再使用。
产品介绍 GeneJET质粒大提试剂盒旨在从重组大肠杆菌E.coli中大规模的提取高质量的质粒DNA。
试剂盒使用基于硅膜技术的离心柱。
每个GeneJET离心柱可回收多达750µg高拷贝质粒DNA。
纯化的质粒DNA可以广泛应用于下游各种分子生物学实验，如限制性内切酶酶切、PCR、克隆、转化、自动测序、体外转录和强健细胞系的转染。
基本原理 收集的细菌细胞经过重悬，加入SDS碱性裂解液后，释放出质粒DNA。
中和得到的裂解液，使得变性的质粒DNA重新退火，而细胞残留物，如蛋白、染色质DNA和SDS沉淀物析出溶液。
通过离心除去细胞碎片和SDS沉淀物。
将含有质粒DNA的上清加入离心柱。
裂解液中的高盐浓度为质粒DNA结合于离心柱硅膜提供了合适的条件，吸附于膜上的DNA通过漂洗以除去污染物，之后通过洗脱缓冲液将其洗脱出来。
4 重要事项 缓冲液准备 将随试剂盒提供的RNaseA溶液加入重悬液，混合均匀。
加入RNaseA后，重悬液可在4℃条件下保存6个月。
如果不经常使用试剂盒，将重悬液进行分装。
分装后向其中一个分包装中按照1mL重悬液中加入40µlRNaseA的比例加入RNaseA，得到工作溶液。
将剩余的RNaseA贮存于-20℃。
工作溶液也可以通过向分装的重悬液里加入RNaseA的方式来配制。
首次使用时，按照下面推荐的体积，向漂洗液Ⅰ（浓缩的）中加入异丙醇，向漂洗液Ⅱ（浓缩的）中加入无水乙醇（96-100％）： 浓缩的漂洗液异丙醇乙醇（96-100％）总体积 10preps（#K0491） 漂洗液Ⅰ 漂洗液Ⅱ 75mL 75mL 25mL - - 125mL 100mL 200mL 25preps（#K0492） 漂洗液Ⅰ 漂洗液Ⅱ 180mL 180mL 60mL - - 300mL 240mL 480mL 每次使用前检查裂解液和中和液是否发生盐析。
若出现盐沉淀，请在37℃下重新溶解，冷却至25℃时再使用。
注意不要剧烈摇晃裂解液。
裂解液和漂洗液Ⅰ含有刺激性物质，当接触皮肤或吸入吞食对人体有害（见第13页安全信息），使用时请戴上手套。
所需额外试剂和仪器 移液器和枪头涡旋仪转速可达到~20000rpm（~48000×g）的离心机，且转头大小适合离心管转速可达到2000~5000×g的水平转头离心机真空管（用于真空法提取）一次性手套乙醇（96-100％）异丙醇 菌株 从各种大肠杆菌E.coli菌株（包括DH10B、DH5α、XL1-Blue、JM109、JM107、TOP10）均可提取获得高质量的质粒DNA。
培养基 本手册中提供的GeneJET质粒大提方案适于使用LB培养基进行细菌培养，至细菌浓度约为2-3（OD600=2-3）。
不推荐使用富营养生长培养基。
5 细菌培养 从划线平板上挑取单克隆，培养于含相应抗性的1-5mLLB培养基中。
在37℃、200-250rpm摇床中培养约8小时。
将起始培养物用LB培养基按1：1000到1:10000的比例进行稀释，在37℃、200-250rpm摇床中培养12-16小时（过夜）。
用于质粒DNA提取的细菌培养物推荐浓度为2-3（OD600=2-3）。
将细菌培养物离心（5000×g）10分钟以收集菌体，去除上清。
收集的菌体可直接使用或贮存于-20℃。
培养体积 一般来说，250mL过夜培养的细菌LB培养物足够提取出高产量的高拷贝或低拷贝质粒DNA。
但是，请注意不要超过推荐的细菌细胞量（培养物体积×OD600），可能会造成所分离DNA的质量下降。
使用细菌培养物的最大体积可以按如下公式进行计算： 最大培养物体积（V），mL=750/OD600 表1各种质粒的拷贝数高拷贝300-700拷贝每细胞pUCvectorspBluescriptvectorspGEMvectorspTZvectorspJETvectors 低拷贝10-50拷贝每细胞pBR322andderivativespACYCandderivatives 极低拷贝最多5拷贝每细胞pSC101andderivatives
6 提纯方法 GeneJET质粒大提试剂盒提供三种用于质粒DNA提纯的优化方案：低速离心法（5000×g）、高速离心法（48000×g）和真空提取法。
方法
A.低速离心法纯化质粒DNA 步骤1 2 345678 9101112 过程按照第6页的说明，培养250mL细菌培养物至其OD600为2~
3。
为了得到更好的结果，请参照第6页的“培养体积”计算出所需培养物的最大体积。
离心（5000×g，10分钟）收集菌体细胞，弃掉上清。
将收集的菌体细胞重悬于6mL重悬液中。
通过涡旋或者移液器吹吸重悬菌体细胞，直至无残留菌块。
注：确保重悬液中已加入RNaseA溶液。
加入6mL裂解液，轻柔颠倒反应管4-6次将其混匀，直至溶液变得黏稠清亮。
室温条件下孵育3分钟。
注：请勿涡旋混匀，避免染色质DNA断裂。
孵育时间不要超过3分钟，以避免超螺旋质粒DNA的变性。
加入6mL的中和液，立即颠倒反应管5-8次以混合均匀。
加入0.8mL内毒素结合液，立即颠倒反应管5-8次以混合均匀。
室温孵育5分钟。
注：加入中和液和内毒素结合液后，请注意将其轻柔混匀，以避免细菌细胞碎片的局部沉淀。
中和后的细菌裂解液浑浊且含有白色沉淀。
加入6mL96％乙醇，立即颠倒反应管5-6次进行混匀。
离心（4000-5000×g，40分钟）以沉淀细胞碎片和染色质DNA。
（如果需要，参看第9页继续采用真空法提取）注：请使用推荐的离心速度。
将上清转移至50mL反应管（未提供）中，避免转移白色沉淀或使其浑浊。
加入6mL96％乙醇，立即颠倒反应管5-6次进行混匀。
将部分上清（~20mL）转移至试剂盒提供的纯化柱中。
请注意不要将纯化柱加样过满。
使用水平转头2000×g离心3分钟。
弃掉流穿液，将纯化柱放回同一收集管中。
注：使用后请封闭装有纯化柱的包装袋!
重复步骤9将剩余的上清经纯化柱处理。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅰ（按照第5页的描述用异丙醇进行稀释）。
使用水平转头3000×g离心2分钟。
弃掉流穿液，将纯化柱放回同一收集管中。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅱ（按照第5页的描述用异丙醇进行稀释）。
使用水平转头3000×g离心2分钟。
弃掉流穿液，将纯化柱放回同一收集管中。
7 13 使用漂洗液Ⅱ重复清洗一次纯化柱（步骤12）。
使用水平转头3000×g离心5分钟以除去残留的漂洗液，弃掉含有 14 流穿液的收集管。
将纯化柱转移至新的50mL收集管中（已提供）。
向纯化柱膜中心 加入1mL洗脱缓冲液。
室温孵育2分钟，使用水平转头3000×g 离心5分钟以洗脱质粒DNA。
注：为了增加所洗脱DNA的浓度，洗脱缓冲液的体积可减少至0.7 15 mL。
但需要注意的是，洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱DNA 的产量。
若使用洗脱缓冲液（0.5mL）再次进行洗脱（可选），DNA的总回 收率可提高20-30％。
·6弃掉纯化柱。
将纯化的质粒DNA用于下游实验或贮存于-20℃。
方法
B.高速离心法纯化质粒DNA 步骤12345 67 过程 按照第6页的说明，培养250mL细菌培养物至其OD600为2~
3。
为了得到更好的结果，请参照第6页的“培养体积”计算出所需培养物的最大体积。
离心（5000×g，10分钟）收集菌体细胞，弃掉上清。
将收集的菌体细胞重悬于6mL重悬液中。
通过涡旋或者移液器吹吸重悬菌体细胞，直至无残留菌块。
注：如第3页的描述，确保重悬液中已加入RNaseA溶液。
加入6mL裂解液，轻柔颠倒反应管4-6次将其混匀，直至溶液变得黏稠清亮。
室温条件下孵育3分钟。
注：请勿涡旋混匀，避免染色质DNA断裂。
孵育时间不要超过3分钟，以避免超螺旋质粒DNA的变性。
加入6mL的中和液，立即颠倒反应管5-8次以混合均匀。
加入0.8mL内毒素结合液，立即颠倒反应管5-8次以混合均匀。
室温孵育5分钟。
注：加入中和液和内毒素结合液后，请注意将其轻柔混匀，以避免细菌细胞碎片的局部沉淀。
中和后的细菌裂解液浑浊且含有白色沉淀。
离心（20000rpm/48000×g，20分钟）以沉淀细胞碎片和染色质DNA。
（如果需要，参看第8页继续采用真空法提取）注：请使用推荐的离心速度。
将上清转移至50mL反应管（未提供）中，避免转移白色沉淀或使其浑浊。
加入1体积的96％乙醇，立即颠倒反应管5-6次进行混匀。
8 将部分上清（~20mL）转移至试剂盒提供的纯化柱中。
请注意不要 将纯化柱加样过满。
使用水平转头2000×g离心3分钟。
弃掉流穿
8 液，将纯化柱放回同一收集管中。
注：使用后请封闭装有纯化柱的包装袋!
9 重复步骤8将剩余的上清经纯化柱处理。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅰ（按照第5页的描述用异丙醇进行 10 稀释）。
使用水平转头3000×g离心2分钟。
弃掉流穿液，将纯化 柱放回同一收集管中。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅱ（按照第5页的描述用异丙醇进行 11 稀释）。
使用水平转头3000×g离心2分钟。
弃掉流穿液，将纯化 柱放回同一收集管中。
12 使用漂洗液Ⅱ重复清洗一次纯化柱（步骤11）。
使用水平转头3000×g离心5分钟以除去残留的漂洗液，弃掉含有 13 流穿液的收集管。
将纯化柱转移至新的50mL收集管中（已提供）。
向纯化柱膜中心 加入1mL洗脱缓冲液。
室温孵育2分钟，使用水平转头3000×g 离心5分钟以洗脱质粒DNA。
注：为了增加所洗脱DNA的浓度，洗脱缓冲液的体积可减少至0.7 14 mL。
但需要注意的是，洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱DNA 的产量。
若使用洗脱缓冲液（0.5mL）再次进行洗脱（可选），DNA的总回 收率可提高20-30％。
15 弃掉纯化柱。
将纯化的质粒DNA用于下游实验或贮存于-20℃。
方法
C.真空法提取质粒DNA 步骤12 345
6 过程按照第7页方法A的步骤1-8或第8页方法B的步骤1-
7，进行细菌细胞收集、裂解和溶解产物澄清步骤。
按照供应商的说明书准备真空歧管。
将GeneJET质粒中提纯化柱放于歧管上。
将部分上清（~20mL）转移至纯化柱中。
请注意不要将纯化柱加样过满。
使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱。
待溶液完全流穿纯化柱后关闭真空。
注：使用后请封闭装有纯化柱的包装袋!
重复步骤
3，抽吸残留溶液。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅰ（按照第5页的描述用异丙醇进行稀释）。
使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱。
待溶液完全流穿纯化柱后关闭真空。
向纯化柱中加入8mL漂洗液Ⅱ（按照第5页的描述用异丙醇进行稀释）。
使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱。
待溶液完全流穿纯化柱后关闭真空。
9 7 使用漂洗液Ⅱ重复清洗一次纯化柱（步骤6）。
为了使纯化柱干燥，可用真空抽吸10分钟，或将纯化柱转移至
一 8 个新的50mL收集管（已提供）中，使用水平转头3000×g离心
5 分钟。
将纯化柱转移至新的50mL收集管中（已提供）。
向纯化柱膜中心 加入1mL洗脱缓冲液。
室温孵育2分钟，使用水平转头3000×g 离心5分钟以洗脱质粒DNA。
注：为了增加所洗脱DNA的浓度，洗脱缓冲液的体积可减少至0.7
9 mL。
但需要注意的是，洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱DNA 的产量。
若使用洗脱缓冲液（0.5mL）再次进行洗脱（可选），DNA的总回 收率可提高20-30％。
10 弃掉纯化柱。
将纯化的质粒DNA用于下游实验或贮存于-20℃。
10 问题 质粒产量低 A260/280未达标准基因组DNA污染RNA污染纯化的质粒中含有多余条带下游酶促反应被抑制体外转录反应产物很少或没有 问题解决方案 可能的原因及解决方案细菌细胞的不完全裂解。
裂解之前，收集的菌体必须充分重悬于重悬液中。
在加入裂解液之前不应看到菌块存在。
裂解液使用前应检查其是否出现盐沉淀。
若发现盐沉淀，将试剂加热至37℃以重新溶解盐沉淀，混合均匀并冷却至25℃后再使用。
不要使用超过推荐的最大菌液量，参照第6页的“培养体积”。
漂洗液Ⅰ中未加入异丙醇。
确保使用前向漂洗液Ⅰ中加入异丙醇。
参照第3页的说明准备漂洗液Ⅰ。
漂洗液Ⅱ中未加入乙醇。
确保使用前向漂洗液Ⅱ中加入乙醇。
参照第3页的说明准备漂洗液Ⅱ。
纯化过程中纯化柱堵塞。
减少每个纯化柱所处理的细菌培养物体积。
当向纯化柱中加入溶菌液时，避免将细胞碎片加入纯化柱中。
细菌培养体积未经优化。
使用下面的公式计算最大的细菌培养体积：最大培养体积（V），mL=750/OD600。
接种细菌太老。
准备新的起始培养物，将新分离的单个菌落在含抗生素的生长培养基中培养，按照第6页的“细菌培养”培养细菌。
离心速度不合适请确保在纯化过程中使用推荐的离心速度，严格按照提供的离心方案操作对于实验的成功非常重要。
质粒DNA未经有效纯化。
减少细菌培养体积，按照第6页“细菌培养”的推荐量。
在细菌裂解和中和步骤中，样本经剧烈涡旋或摇晃。
为了避免基因组DNA污染，轻柔颠倒离心管4-8次以将溶液混匀（步骤3和4）。
裂解细胞（步骤3）不要超过3分钟。
细菌在LB培养基中培养时间不要超过16小时。
可以使用T7聚合酶（#EP0081）除去所纯化DNA中残留的基因组DNA。
首次使用前，重悬液中未加入RNaseA。
参照第5页的说明，确保使用前向重悬液中加入RNaseA。
细菌裂解中质粒DNA变性。
相比于超螺旋DNA，变性质粒DNA迁移率较快。
变性质粒不适用于接下来的酶切操作，如限制性酶切。
为了避免质粒变性，裂解细胞（步骤3）不要超过3分钟。
纯化的质粒DNA中含有乙醇。
洗脱DNA前将纯化柱彻底干燥（离心法的第13步或真空法的第14步）。
纯化的质粒DNA中含有RNaseA。
如果纯化的质粒DNA用于体外转录，可使用GeneJETPCR纯化试剂盒（#K0701）或酚氯仿抽提方法重新纯化线性化的质粒DNA。
11 参考文献
1.BirnboimH.C.,andDoly,
J.(1979)ArapidalkalinelysisprocedureforscreeningbinantplasmidDNA.NucleicAcidsRes.7,1513-1522.2.Vogelstein,B.andGillespie,
D.(1979)PreparativeandanalyticalpurificationofDNAfromagarose.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76,615-619. 产品使用限制本产品的开发、设计及销售专供研究和体外试验使用。
本产品不得用于诊断试验或药物 开发，也不适合向人或动物注射。
了解本产品的材料安全数据表，请浏览/onebio。
©2012ThermoFisherScientific，版权所有。
所有商标均归ThermoFisherScientific公司 或其子公司所有。
12 安全信息 裂解液 C具有腐蚀性辨别危险的成分标签：氢氧化钠 风险术语R34安全术语S20S23S26S36/37/39S45S60 引起灼伤 使用时，不得进食，饮水请勿吸入气体/烟雾/蒸汽/喷雾若溅入眼睛，立即用大量清水冲洗，并寻求医生治疗穿戴适当的防护服、手套和眼睛/面保护发生事故时或感觉不适时，立即求医（可能时出示标签）该物质及其容器必须作为危险废物处置 中和液 Xi有刺激性辨别危险的成分标签：乙酸 风险术语 R36/38对眼睛和皮肤具有刺激性 安全术语 S23 请勿吸入气体/烟雾/蒸汽/喷雾 S26 若溅入眼睛，立即用大量清水冲洗，并寻求医生治疗 S37 戴适当手套 S45 发生事故时或感觉不适时，立即求医（可能时出示标签） S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置 漂洗液Ⅰ Xi
有害辨别危险的成分标签：盐酸胍 风险术语R22R36/38安全术语S23S26S36/37S60 吞食有害对眼睛和皮肤具有刺激性 请勿吸入气体/烟雾/蒸汽/喷雾若溅入眼睛，立即用大量清水冲洗，并寻求医生治疗穿戴适当的防护服和手套该物质及其容器必须作为危险废物处置 13
声明：
该资讯来自于互联网网友发布，如有侵犯您的权益请联系我们。
