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2 ICS07.080CCSA40 团 体 CAQI 标 准 T/CAQIXXXX—XXXX 植物源性产品物种鉴别基因条码技术Sanger测序法 IdentificationofspeciesinplantproductsbyDNAbarcodingSangersequencing （征求意见稿） XXXX-XX-XX发布 XXXX-XX-XX实施 中国质量检验协会发布 T/CAQIXXXX—XXXX 前言 本文件参照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本文件由中国检验检疫科学研究院提出，本文件由由中国质量检验协会归口。
本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中检国控科技集团有限公司、谱尼测试集团股份有限公司、江苏奥迪康医学科技股份有限公司、上海翊辉生物科技有限公司、国正检验认证有限公司、中检科创（北京）测试认证有限责任公司。
本文件主要起草人：吴亚君，杨艳歌，庄雷，韩建勋，宋曈，乐粉鹏，刘鸣畅，王洪越，袁吉泽、薛晓晶，王芳。

I T/CAQIXXXX—XXXX 植物源性产品物种鉴别基因条码技术Sanger测序法 1范围本文件规定了基因条码技术Sanger测序法的原理、主要试剂、主要仪器设备、样品采集与制备、检 验步骤、质量控制、结果判定与表述、检验过程中防止交叉感染的措施。
本文件适用于植物源性食品、农产品、化妆品、中药材等产品的植物物种定性检测。
注1：物种参见资料性附录
A。
注2：方法的检出限为10%（质量比）。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T3500进出口食品安全生物学检测抽样规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
基因条码DNAbarcode指生物体一段公认的能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。

1 T/CAQIXXXX—XXXX Sanger测序法Sangersequencing用于基因测序的双脱氧链末端终止法,在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断，产生以
A、T、
C、G结束的四组不同长度的核苷酸链,通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。
基因条码技术DNAbarcoding采用基因测序技术对物种的基因条码进行识别，利用其种内特异性和种间多样性实现对物种的快速鉴定的技术。
质量评分Qualityvalue（QV）仪器测序过程中，软件分析测序信号时，根据预测到的碱基解读错误率，给出针对每个碱基所对应的质量评分，用以评估单个碱基的测序质量。
4缩略语 下列缩略语适用于本文件。
BOLD：生命条形码数据系统（TheBarcodeofLifeDataSystem）bp：碱基对（Basepair）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrithylammoniumbromide）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphate）ddNTP：双脱氧核糖核苷三磷酸（Dideoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethyleneetraaceticacid）NCBI：美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）TaqDNA聚合酶：耐热DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane]
2 T/CAQIXXXX—XXXX 5原理 基于基因条码技术，根据样品类型选择基因条码引物，扩增基因条码序列并双向测序，在数据库中对序列进行比对，确定物种。
6主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。
实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。
TaqDNA聚合酶。
胶回收试剂盒。
分子量标准品（最小片段≥20bp，最大片段≤2000bp）。
琼脂糖。
溴化乙锭。
三氯甲烷。
异丙醇。
无水乙醇。
dNTP混合液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。
10×PCR缓冲液。
无菌双蒸水。
70%乙醇。
1.2mol/LNaCl溶液。
20mg/mL蛋白酶K溶液。
10×电泳缓冲液：Tris54g/L，硼酸27.5g/L，10mmol/LEDTA，pH8.0。
CTAB提取液：20.00g/LCTAB，81.9g/LNaCl，12.1g/LTris，7.50g/LNa2EDTA，pH8.0。
CTAB沉淀液：5.00g/LCTAB，2.50g/LNaCl，pH8.0。
7主要仪器设备 PCR仪。

3 T/CAQIXXXX—XXXX 凝胶成像仪。
电泳仪。
离心机：离心力17000g。
核酸蛋白分析仪。
Sanger测序仪。
组织研磨器。
涡旋混匀仪。
pH计：精度为0.01。
微量移液器：0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，200μL~1000μ
L。
天平：分度值0.1mg。
8样品采集与制备 采样抽样采样抽样参见SN/T3500。
制备8.2.1总则样品充分混匀，分成三等分，作为检样、复检样和贮存样，样品的制备应防止交叉污染和组分改变。
8.2.2粉末状样品混匀后直接分装，收集到50mL离心管或密封袋中，4°C~8°C保存。
8.2.3液态样品液态样品混匀，直接分装-20°C以下冻存。
8.2.4固态样品固态样品依次用70%乙醇和双蒸水冲洗2~3次，粉碎，收集到50mL离心管或密封袋中，4°C~8°C保存。

4 T/CAQIXXXX—XXXX 9检验步骤 实验设置 检测设置阳性对照和空白对照（无菌双蒸水），其中阳性对照和空白对照DNA提取1次，待检样品提取设置2个重复；所有DNA样品的PCR扩增设置2个重复。
DNA提取 按GB/T19495.3-2004附录C中C.6.2CTAB-2中的试验方法，并根据实际需要加入2mL~10mLCTAB提取液，同时加入20μL~100μL20mg/mL蛋白酶K（蛋白含量高的样品，用量增加一倍），65°C温育1h~2h（或过夜），期间不时震荡混匀。
最后用50μL~100μL无菌双蒸水溶解DNA，混匀，-20°C以下冻存。
DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。
DNA的浓 度按照式
（1）计算，每个样品重复测三次，取平均值。
通过A260/A280比值判断提取出的DNA的纯度。
若A260/A280值在1.7～2.1之间，说明DNA纯度较高。
C=A
×N×50/1000 ••••••••••••••••••••••••••
（1） C——DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）； A——260nm处的吸光值； N——核酸稀释倍数。
PCR扩增 9.4.1引物 扩增和测序引物见附录
A。
9.4.2反应体系 采用TaqDNA聚合酶扩增，酶及扩增体系见附录C中C.2。
9.4.3反应参数
5 T/CAQIXXXX—XXXX rbcL基因：95℃预变性10min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
psbA基因：95°C预变性4min；94°C变性30s，55°C退火1min，72°C延伸1min，40个循环；72°C再延伸10min；4℃保存。
ITS基因：94°C预变性5min；94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，40个循环；72°C再延伸10min；4℃保存。
matK基因：94℃预变性1min；94℃变性30s，52℃退火20s，72℃延伸50s，35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
9.4.4电泳检测 取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。
在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。
将25μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，同时点加分子量标准品，9V/cm电泳仪中恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。
用凝胶成像仪观察电泳结果并记录。
9.4.5胶回收及PCR产物纯化 胶回收及PCR产物纯化见附录C中C.2。
克隆纯化（适用于多组分和未知样品）一般地，PCR扩增后，电泳检测时，如发现多条扩增带，则提示可能为混合样品，需进行克隆纯化，再测序。
若扩增为单一条带，但测序时发现有多峰现象，提示可能为混合样品，也进行克隆纯化，再测序。
克隆纯化方法见附录D中D.5。
测序测序步骤参见附录D中D.6。
序列分析
6 T/CAQIXXXX—XXXX 使用序列拼接软件对双向序列进行拼接，去除标签序列和低质量区。
将拼接后的序列在BOLD或NCBI数据库中进行序列比对，根据相似度判定物种。
注1：BOLD网址：/注2：NCBI数据库网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/注3：使用BOLD具体步骤：BOLD数据库→点击“鉴别”（Identification）→选择“植物鉴别”（PlantsIdentification）→选择数据库（SearchDatabases）（建议选择AllBarcodeRecordsonBOLD）→粘贴fasta格式的序列（Entersequencesinfastaformat）→点击“提交”（Submit）。
使用NCBI数据库具体步骤：NCBI数据库→选择“BLAST”检索（BLAST）→选择“核酸比对”（NucleotideBLAST）→输入要查询的序列（EnterQuerySequence）→检索数据库选择“其他”｛Database[Others(nretc.)]｝→点击“比对”（BLAST）。
10质量控制 总体要求本章所列出的质量控制均应实现，有一条不满足时，实验视为无效，重新操作。
PCR质量控制10.2.1阳性对照 1)rbcL微型基因条码片段电泳长度275bp左右；2)psbA基因条码片段电泳长度450bp左右3)ITS基因条码片段电泳长度500bp左右；4)matK基因条码片段电泳长度800bp左右。
10.2.2空白对照无PCR扩增条带。
基因克隆质量控制阳性对照转化感受态细胞长出大量菌落，空白对照无菌落。

7 T/CAQIXXXX—XXXX 序列质量控制10.4.1对序列进行质量核验，平均QV≥30，QV＜20的碱基数不超过序列总长度的1%。
10.4.2rbcL微型基因条码段经序列拼接后，保证测序峰图的长度≥200bp。
10.4.3psbA基因条码片段经双向序列拼接后，保证测序峰图的长度≥300bp。
10.4.4ITS基因条码片段经双向序列拼接后，保证测序峰图的长度≥350bp。
10.4.5matK基因条码片段经双向序列拼接后，保证测序峰图的长度≥600bp。
11结果判定与表述 结果判定在满足第9章全部质量控制的前提下，检测结果的判定如下：——样品序列与数据库相似度≥95%，检测结果为相似度最高的物种。
——若样品序列与数据库相似度＜95%，则重复实验。
若再次检测后，相似度≥95%，则检测结果 为相似度最高的物种；若相似度仍＜95%，则本文件方法不适用于该样品。
结果表述在样品序列与数据库相似度≥95%，为相似度最高的物种时，其检测的结果应表述为样品中含有xx来源植物物种。
12检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403-2008中附录D的规定执行。

8 T/CAQIXXXX—XXXX AA 附录A（规范性）扩增与测序引物 表A.1植物基因条码引物序列 引物名称 引物序列（5'→3'） 基因 rbcL-
F F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGCAGCATTCCGAGTAAC rbcL rbcL-
R R:CAGGAAACAGCTATGACAGTAAACATGTTAGTAACAG psbA-trnH-fwdpsbA-trnH-rev F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATGCATGAACGTAATGCTCR:CAGGAAACAGCTATGACCGCGCATGGTGGATTCACAATCC psbA ITS-2F F:TGTAAAACGACGGCCAGTATGCGATACTTGGTGTGAAT ITS-3R R:CAGGAAACAGCTATGACGACGCTTCTCCAGACTACAAT ITS matK3F-KIMmatK1R-KIM F:TGTAAAACGACGGCCAGTCGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAGR:CAGGAAACAGCTATGACACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC matK 注1：表中阴影标注为M13F、M13R标签。
注2：水果物种鉴别推荐使用psbA和matK基因条码，中药草、药食同源、谷物和坚果等物种鉴别推荐使用ITS、psbA
和matK基因条码。
注3：深加工样品物种鉴别推荐使用rbcL、psbA和ITS基因条码。
表A.2测序标签引物序列 引物名称M13F(-21)CM13R(-27)
C 引物序列5’–3’TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGAAACAGCTATGAC
9 T/CAQIXXXX—XXXX BB 附录B（资料性）鉴别物种目录 表B.1、B.2、B.3列出的物种为标准制定过程中进行试验的物种信息。
表B.1植物基因条码可鉴别的水果物种 种类序号物种 拉丁名称 种类序号物种 1苹果 MaluspumilaMill. 15蓝莓 2梨仁果类3山楂 PyrusL.Crataeguspinnatifida 16蔓越莓17覆盆子 4枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl. 18桑葚 柑果类5桔子CitrusreticulataBlanco 19黑加仑 6橙子Citrussinensis(
L.)Osbeck.浆果类20猕猴桃 7枣 ZiziphusjujubaMill. 21石榴 8荔枝 LitchichinensisSonn. 22葡萄 9龙眼DimocarpuslonganLour. 23草莓 10杨梅Myricarubra(Lour.)S.et. 核果类11桃 AmygdaluspersicaL. 24蛇莓25香蕉 12杏 ArmeniacavulgarisLam. 26菠萝 13樱桃Cerasuspseudocerasus(Lindl.)瓜果类27西瓜
G.Don 14椰子 Cocosnucifera 拉丁名称iniumcorymbosumL.iniummacrocarponRubuscorchorifoliusL.f. MorusalbaL. RibesnigrumL.ActinidiaChinensisPunicagranatumL. VitisviniferaL.FragariaananassaDuch.Duchesneaindica(Andr.)Focke MusananaLour.osus Citrulluslanatus 表B.2植物基因条码可鉴别的药食同源和中草药植物物种 种类序号物种 拉丁名称 种类序号 1莲子 Glycinemax
7 2百合 Liliummartagon
8 3黑芝麻Sesamumindicum
9 4杏仁 Prunussibirica 10 5枸杞 Lyciumchinense 11 药食同源6黑枸杞 Lyciumchinensevoucher 12 7茯苓Poriacocos(Fr.)Wolf. 13 8芡实 Euryaleferox 14 9山药Dioscoreapersimilis中草药15 10甘草Glycyrrhizauralensis 16 11白芷 Angelicadahurica 17 1葛根 Puerariamontana 18 2炒酸枣仁Ziziphusjujuba 19 3麦冬 Liriopespicata 20 中草药4黄芪 Astragalus 21 membranaceus 5苦参Sophoraflavescens 22 6人参 Panaxginseng 物种三七白芍黄连白附子益母草 丹参 大黄当归川芎红花 白术 白芨白蔹白薇 玫瑰 罂粟 拉丁名称PanaxnotoginsengPaeonialactiflora CoptischinensisTyphoniumgiganteumLeonurusjaponicus Salviamiltiorrhiza RheumofficinaleAngelicasinensisLigusticumsinenseCarthamustinctorius AtractylodesmacrocephalaBletillastriataAmpelopsisjaponicaVincetoxicumatratum Rosarugosa PapaversomniferumL. 10 T/CAQIXXXX—XXXX 种类序号物种1绿豆2燕麦 谷物3赤豆4黑豆5薏米6黑米 表B.3植物基因条码可鉴别的谷物和坚果物种 拉丁名称VignaradiataAvenasativaVignaangularisGlycinemaxCoixlacryma-jobiOryzasativa 种类序号 物种
1 腰果
2 核桃 坚果34 榛（子）花生
5 葵花（子） 拉丁名称identale JuglansnigraCorylusheterophylla ArachishypogaeaHelianthusannuusL. 11 T/CAQIXXXX—XXXX C.1反应体系 CC 附录C（资料性）酶和试剂盒组成及使用说明 C.1.1TaqDNA聚合酶组成TaqDNA聚合酶室温或冰上融化，涡旋或者颠倒混合，离心，直接吸取，-20°C存放。
表C.1TaqDNA聚合酶组成 试剂名称Extract-N-AmpPCRreactionmix（PCR聚合酶混合物）注：以Extract-N-AmpPCRreactionmix1)为例。
C.1.2扩增体系 体积12mL 上、下游引物各0.5μL（引物浓度10μmol/L），12.5μLPCR聚合酶混合物，5μLDNA模板（10ng/μL~100ng/μL），用无菌双蒸水补足体积至25μ
L。
C.2胶回收及PCR产物纯化试剂盒C.2.1试剂盒组成 表C.2胶回收及PCR产物纯化系统组成 产品组成MembraneBindingSolution（膜结合液） MembraneWashSolution(膜洗脱液)Nuclease-FreeWater（无核酸酶纯水）Wizard®SVMinicolumns（纯化柱） CollectionTubes(2mL)（收集管） 体积/数量（50次）20mL15mL3.75mL50个50个 1)Extract-N-AmpTMBloodPCRkit和Extract-N-AmpPCRreactionmix均是Sigma-Aldrich公司提供的产品的商品名。
给出这一信息是为 了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。
如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
12 T/CAQIXXXX—XXXX 注：Wizard®SVGelandPCRClean-UpSystem)2为例。
C.2.2操作步骤电泳检测结果为单一目的条带时，可直接对PCR产物进行纯化；若非单一条带，在紫外灯下小心地 把所需的DNA的片段切下来，并尽量去除多余的凝胶，再进行胶回收。
具体步骤如下：1）若为PCR产物，则直接加入等体积的膜结合液；若为凝胶，称量凝胶块的重量记为Xg，则加入 XmL的膜结合液（即：若凝胶的重量为0.2g，则加入膜结合液0.2mL)；置于50°C~65°C温浴10min至凝胶完全融化，其间每隔2min~3min混匀一次。
2）转移混合溶液至装于2mL收集管的纯化柱内，室温放置1min，14000g离心1min，弃滤出液。
3）加入700μL膜洗脱液（使用前按要求加入无水乙醇），14000g离心1min，弃滤出液。
4）重复加入700μL膜洗脱液，室温下，14000g离心5min，弃滤出液；14000g再次离心1min，弃滤出液。
5）转移柱子至1.5mL离心管中，加入20μL~50μL无核酸酶纯水或者无菌双蒸水，室温放置1min，14000g离心1min，纯化后溶液-20°C以下保存。
2)Wizard®SVGelandPCRClean-UpSystem是Promega公司提供的产品的商品名。
给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。
如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
13 T/CAQIXXXX—XXXX DD 附录D（资料性）克隆测序D.1适用范围 本方法适用于多组分和未知样品克隆纯化，及所有样品的测序。
D.2缩略语 D.2.1Kan+：卡那霉素（Kanamycin）D.2.2LB：大肠杆菌基础培养基（Luria-Bertani） D.3主要试剂 D.3.1琼脂D.3.2LB肉汤D.3.3DNA连接酶D.3.4DNA测序试剂盒D.3.5感受态细胞D.3.6载体D.3.7甲酰胺D.3.8无菌双蒸水D.3.995%乙醇D.3.1070%乙醇 D.4主要仪器设备 D.4.1超净工作台。
D.4.2恒温水浴锅。
D.4.3涡旋混匀仪。
D.4.4离心机：离心力17000g。
D.4.5微量移液器：0.5μL～10μL，10μL～100μL，20μL～200μL，200μL～1000μ
L。
D.4.6涡旋混匀仪。
14 T/CAQIXXXX—XXXX D.4.7恒温摇床。
D.4.8恒温培养箱。
D.4.9PCR仪。
D.4.10Sanger测序仪。
D.5克隆纯化（适用于多组分和未知样品） 多组分和未知样品的PCR产物连接PCR®2.1载体3)，连接反应体系共10μ
L，其中包含：PCR产物1μL，5×T4DNA连接反应缓冲液2μ
L，PCR®2.1载体（25ng/μL）2μ
L，无菌双蒸水4μ
L，连接4°C过夜连接。
将感受态细胞置于冰上融化，在超净工作台中，向100μL感受态细胞悬液中加入1μL的连接产物，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰上放置30min。
将离心管置于42°C恒温水浴锅中90s，然后快速转移到冰上放置2min，注意不要摇动离心管。
向离心管中加入900μL无抗生素的LB液体培养基，37°C120g振荡培养1h，使菌体复苏。
离心机上2000g离心，去除700μL上清，用移液枪轻轻吹打混匀以悬浮菌体后将其涂布于添加Kan+固体LB培养基（含琼脂）中，37°C恒温培养箱中倒置培养12h～16h。
挑取单菌落（≥20个）于1mL含Kan+抗生素的LB液体培养基，37°C恒温摇床中孵育10h～16h，取1μL菌液进行PCR，电泳检测，挑选阳性产物进行测序。
D.6测序 测序反应体系共10μ
L，其中包含DNA测序试剂盒4)（5×Sequencing缓冲液1μ
L，BigDyeTerminatorV3.12μL），10μM引物0.16μL（正向测序用引物M13F，反向测序用M13R），无核酸酶纯水5.84μ
L，纯化后的PCR产物或质粒DNA1μ
L。
用铝箔纸薄膜密封96孔板。
PCR仪扩增，反应条件为：96°C2min；96°C30s，55°C40s，60°C4min，30个循环；4°C保存。
取下密封膜，每孔加入15μL无菌双蒸水和65μL95%乙醇。
混合后室温放置15min。
3700g8°C离心45min。
去除上清，离心机中放入吸水纸，96孔板倒置于纸上，快速离心（不超过1200g），加入150μL70%乙醇，混合后4000g8°C离心15min。
去除上清，离心机中放入吸水纸，96孔板倒置于纸上， 3)PCR®2.1是一种TA克隆载体，是Invitrogen公司提供的产品的商品名。
给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。
如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
4)DNA测序试剂盒以AppliedBiosystems公司的BigDye®Terminatorv3.1CycleSequencingKit为例，给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。
如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
15 T/CAQIXXXX—XXXX快速离心（不超过1200g），室温放置5min使乙醇挥发，加入10μL甲酰胺，95°C10min，立即放入冰水浴10min，用Sanger测序仪测序。
注：以上试剂盒均可采用其他等效产品。
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