ProteinSolutions 免疫组化技术 免疫组化技术的全称为免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）。
免疫组化于上世纪40年代出现，在60年代后发展迅速，经历了几十年的快速发展，该技术应用范围已覆盖到医学各个学科，已经成为当今生物医学形态、功能、代谢综合研究的一项有力工具。
什么是免疫组化技术（IHC）？ 免疫组化，是用标记的特异性抗体对组织内抗原的分布进行定性，定位分析的检测技术。
免疫组化技术原理 免疫组化技术原理是：从待检测组织或细胞中提取蛋白作为抗原，通过免疫动物获得特异性抗体，利用抗体探测并结合组织（或细胞）中的抗原。
再利用带显色剂标记的二抗检测，对细胞复染显示细胞轮廓，通过显微镜观察，可以实现对组织或细胞内蛋白的定性、定位研究。
免疫组化技术与WB、ELISA区别 免疫组化、WesternBlot、ELISA被称为免疫学三大工具，分别用于定位，定性和定量检测。
免疫组化 WesternBlot ELISA 实验原理免疫反应；化学显色反应免疫反应；化学显色反应免疫反应；化学显色反应 检测样品组织石蜡切片或冰冻切片蛋白 定位检测是 否 血清、细胞、组织培养上清等否 定位检测是定量检测半定量[1] 是半定量 是定量检测 表1：免疫组化、WesternBlot、ELISA的区别 Tel:(025)5889-4959 Sales@ 活性蛋白整体方案 ActiveProteinSolutions 免疫组化技术应用 定位和定性是免疫组化最大的优势。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定位较直接准确、定性灵敏度高，是定位检测分析首选方法，尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面： 恶性肿瘤的诊断与鉴别定性；确定转移性恶性肿瘤的原发部位；对某类肿瘤进行进一步的病理分型；软组织肿瘤诊断；为临床提供治疗方案的选择；近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。
免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。
免疫组化实验步骤 根据标记物的不同（标记物有荧光染料、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金等），免疫组化方法可以分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
其中比较常用的是免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法，本文以免疫酶法为例，对免疫组化的操作流程做一介绍。
实验步骤 免疫酶法的实验流程为：对事先制备好的组织石蜡切片进行脱蜡与水化→细胞通透→抗原修复→封闭特异性蛋白→
孵育及染色→脱水、封片、镜检。
根据孵育与显色反应等步骤操作方法的不同，可以将免疫酶法进一步分为Elivision二步法、SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法）、SABC法（链霉卵白素-辣根酶标记生物素法）等方法。
即用型Elivision快速酶免疫组化二步法的孵育及显色流程：一抗+酶标二抗+辣根酶底物显色。
SP法的孵育及显色流程：一抗+生物素二抗+滴加试剂SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物）+辣根酶底 Tel:(025)5889-4959 Sales@ 活性蛋白整体方案 ActiveProteinSolutions 物显色，SP是最常用的实验方法。
ABC法的孵育及显色流程：一抗+生物素二抗+滴加试剂ABC（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）+辣根酶底物显色。
SABC法的孵育及显色流程：一抗+生物素二抗+滴加试剂SABC（链霉卵白素-辣根酶标记生物素复合物）+辣根酶底物显色。
脱蜡与水化：脱蜡与水化的目的是确保抗体能够充分与组织中抗原结合发生反应。
细胞通透：细胞通透的目的是使抗体能充分的进入胞内进行结合反应。
一般用TritonX-100、蛋白酶K等 通透液对细胞进行通透。
封闭内源性过氧化物酶：封闭内源性过氧化物酶的主要目的是降低内源性过氧化物酶活性。
在传统的ABC 法和SP法等方法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的影响，必须用H202等进行灭活。
抗原修复、暴露抗原决定簇：在石蜡切片制备过程中，组织中部分抗原由于发生了蛋白之间交联及醛基的 封闭作用从而失去抗原性，需要通过抗原修复，使细胞内抗原决定簇重新暴露。
封闭非特异性蛋白：组织切片上有些剩余的位点可以与抗体非特异性结合，造成后续结果的假阳性，因此 要进行非特异性蛋白封闭。
封闭血清通常选择与二抗同一来源的非免疫血清，血清中有一些动物自身的抗
体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，从而避免了抗体与组织切片的非特异性结合。
一抗孵育：通过孵育使一抗特异性的结合底物。
二抗孵育：二抗带有生物素标记（二步法二抗带有的标记为显色标记），孵育后二抗与一抗结合，目的是检测一抗。
染色：常用的染色方法有SP法、ABC法、SABC法等。
其原理是利用抗生物素蛋白或卵白素与二抗上的生物素结合，从而间接达到将显色剂与二抗结合的目的。
显色：在免疫组化中，由于抗原抗体形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用（例如酶与底物的显色反应），使复合物显色，便于在显微镜下观察。
Tel:(025)5889-4959 Sales@ 活性蛋白整体方案 ActiveProteinSolutions 复染：复染的目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，常用的复染试剂为苏木素。
脱水、透明、封片、镜检 结果分析 免疫组化实验通常需要设置阳性对照、阴性对照（或替代对照）（阳性对照是排除方法和实验系统有无问题；阴性对照与替代对照是排除有无非特异性染色）。
一般情况下，阳性对照颜色的特点为：Ag定位，包浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。
且染色的强度不同（颜色深浅不一）；阴性对照的特点为：染色细胞与组织无区别，颜色具有弥散性，分布均匀。
阳性对照 阴性对照（或替代对照） 实验组 结论 - - - 操作错误 + + + 非特异性反应 + + - 阴性对照含定位Ag - - + 阳性对照不含定位Ag - - + 受检组织非特异性染色 + - + 受检组织不含定位Ag + - + 受检组织含定位Ag 表2：免疫组化实验可能出现结果分析对照表注：+表示实验有特异性染色；-表示实验无特异性染色上表为免疫组化实验中可能出现的结果，由上表可以看出，只有6、7组的实验结果有意义。
1~5的实验结果因IHC技术操作存在错误等原因使对照组的实验结果失去对照意义，必须重复实验或者换用Ab。
说明：免疫组化实验可以对结果进行定量分析，但要实验得到的必须是高质量的染色切片，要求背景染色浅且特异性染色较深，这样分析的结果才会比较准确。
Tel:(025)5889-4959 Sales@ 活性蛋白整体方案 ActiveProteinSolutions 实验失败常见问题分析： 为什么在显微镜下观察发现所有的切片都成阴性？答：这种现象主要是由操作不当导致，可能的原因有：
1.染色操作不当，致使染色失败；
2.漏加一种抗体或者制备出的抗体没有活性;
3.缓冲液中有叠氮化钠，抑制了酶的活性；
4.复染或脱水剂使用不当等。
建议逐一排查，找到原因后重新进行实验。
在显微镜下观察发现所有的切片都成阳性，这是为什么？答：与上一个问题类似，出现的原因也是试验操作存在问题，可能的原因有：
1.切片在染色过程中抗体过浓，或者干片了；使用的呈色底物溶液已变色或呈色反应时间过长；
3.抗体温育的时间过长等。
在显微镜下观察发现切片的背景很深，这是为什么？答：以下几方面会导致切片的背景过深：
1.蛋白质封闭不够或所用血清溶血，造成抗体的非特异性反应；
2.内源性过氧化酶没有完全阻断，显色过程中过氧化酶与酶底物反应，造成背景；
3.底物呈色反应时间过长或呈色反应后漂洗不彻底。
注意事项 切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。
一抗的冲洗原则：单独冲洗，防交叉反应污染；温柔冲洗，防止切片脱落；推荐浸洗方式。
有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。
注释：[1]半定量是介于定性与定量之间的一种分析方法，指虽然可以得到一个量值，但是这个量值只能从趋势上进行分析，例如大量、少量、微量、痕量等，而得不到一个具体的数值（例如浓度等）。
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