目录 背景介绍.......................................................................................................................................................

2 使用方法.......................................................................................................................................................

3 一、安装imageJ及插件

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1、下载地址.......................................................................................................................................

32、插件安装方法

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3 二、Deconvolution

使用方法........................................................................................................

41、生成标准的

PSF..........................................................................................................................

42、数据

Deconvolution..................................................................................................................

5 CIBR 背景介绍 反卷积是一种计算密集型图像处理技术，通过该技术，可以提高显微图像的对比度和清晰度。
与共聚焦显微镜不同，宽视场显微镜允许探测器接收到的所有光通过，因此许多来自非焦面的光也会被接收到，使得图像变得模糊，损失很多精细的细节。
反卷积技术的主要任务就是去除非焦平面上的模糊。
点扩展函数(PointSpreadFunction，PSF)描述了一个成像系统对于点光源或者是点物体的响应，也可以理解其为光学系统对于脉冲的响应函数，一般用该指标来衡量重建后的系统分辨率。
在荧光显微镜、望远镜或是光学显微镜的非相干成像系统中，图像形成过程是 CIBR线性的，并由线性系统理论描述。
这意味着两个单独成像的物体A和B的成像结果等同于 两物体各自成像结果的加和。
如上图所示，在线性系统中，对于任意成像目标Object为I1和其对应的像Image为I2可以表示成：I2=I1∗h；h是系统函数，同时这个卷积系数h也是PSF，因为当I1为冲击函数时：I2=h。
因此一个理论的系统PSF可以反过来通过去卷积算法来消除系统的失真，还原所取图像本来的样子。
需要注意的是，由于取到的单张图片中非焦面的信息来自于多个层面，2D的去卷积只能消除焦平面横向相邻像素的弥散影响，对非焦平面的背景不能很好的去除，因此反卷积在3D图像中处理后的效果会更加清晰、准确。
使用方法
一、安装imageJ及插件
1、下载地址 下载地址：https://imagej.nih.gov/ij/所需插件：Diffraction_PSF_3D、Parallel_Spectral_Deconvolution&DeconvolutionLab2；插件下载地址：http://fiji.sc/Diffraction_PSF_3Dhttp://fiji.sc/Parallel_Spectral_Deconvolution CIBR&http://bigwww.epfl.ch/algorithms/deconvolutionlab/
2、插件安装方法 1)将下载后文件复制到ImageJ文件夹→plugins文件夹中后，重启ImageJ； 2)重新打开后，在工具栏中plugins菜单下即可找到DiffractionPSF3D、ParallelSpectralDeconvolution、DeconvolutionLab2三个功能。

二、Deconvolution使用方法
1、生成标准的PSF a)首先需要根据实际拍摄条件生成一个标准的PSF，使用DiffractionPSF3D功能Plugins→DiffractionPSF3D； CIBRIndexofrefractionofthemedia:拍摄时使用物镜的所匹配的介质的折射率， 例如：Air:1.000Water:1.333等，可在网上查找NA：所使用物镜的数值孔径wavelength：荧光的发射波长（注意不是激发波长）Longitudinalsphericalaberration纵向球差畸变：由于大部分实验室都无法测量该参数，填写0.00对于计算结果相对来说比较好一些Imagepixelspacing：查找所使用CCD的pixelsize参数，可在CCD的技术手册中查找。
若pixelsize：6.45μmx6.45μm，40×的物镜拍摄，那么Imagepixelspacing为6.45μm/40=0.16μm，此处的单位为nm,.所以应该填写160Slicespacing:单位为nm.2D:填写
0 3D:实际所取图像的步长，若3D数据中，每50nm取一张图片，填写50Width&Height：即图像行&列的像素点个数；若取图的大小为1024×512，width：1024；height：512Depth：2D:填写1；3D：即图像的层数Nomolization:可以保持默认值Title:所生成PSF的文件名b)所有数据填写完成后，点击OK,则会生成一个2D/3D的PSF,点击保存，后面会用到。
CIBR
2、数据Deconvolution 2D灰度图： 使用ImageJ打开需要处理的图片（注意：该算法只能计算灰度图），所以先介绍grey时的方法，然后介绍如何处理color数据。
注意2D的数据中不要存在过曝点以及噪声过高的情况，会影响处理结果。
a)首先应确保数据为灰度图（8/16/32bit），打开要处理的图像和前面生成的PSF图片数据 b)打开ParallelSpectralDeconvolution（Plugins→ParallelSpectralDeconvolution→2DSpectraldeconvolution/3Dspectraldeconvolution） Grey2D: CIBR Image:需要处理的数据PSF:上一步生成的PSFMethod:GeneralizeTikhonov(reflexive)algorithm剩下的参数为默认值，点击deconvolve,生成处理后的数据。
2D彩色图片： 在理解上面的步骤的基础上，介绍colorimage的处理方法：首先将colorimage（RGB）图像通过通道拆分成三个通道（Red,Green,Blue）, CIBR 注意：在生成理论PSF时，其中PSF的参数和荧光的发射波长有关，所以
R,G,B三个通道分别根据使用荧光的发射波长生成三个理论的PSF 然后分别对三个通道使用对应的PSF进行deconvolution处理后，再进行通道合并。
通道拆分：Image→Color→Splitchannels通道合并：Image→Color→Mergechannels 3D灰度图：去卷积对于3D图像来说，可以有更好的效果，它可以有效地交叉 参考不同深度的数据以消除各层的模糊。
a)首先将3D的图片(灰度图)保存在一个文件夹中，拖到工具栏中（：若不是灰度图， 请参照color3Ddeconvolution的方法） CIBR拖入后，弹出对话框： 什么都不勾选，点击yes。
注意：如果3D的图片很大，如果对所有的数据进行处理会花费很长时间，建议对3Dstack进行裁剪（crop），只将感兴趣的区域裁剪出来并保存。
Crop处理方法：打开stack，在工具栏中选择所需要的形状进行ROI选取，然后image→crop，点击后会生成crop后的图片，进行保存 b)然后，使用DiffractionPSF3D生成一个3D的PSF，进行保存。
CIBR注意：若是裁剪后的图片，根据实际的Width&Height进行填写 例如：原始数据为672×712pixels，crop后成为160×182pixels，在生成PSF中Width&Height应填写160&182。
c)最后，使用Deconvolutionlab2进行去卷积Plugins→Deconvolutionlab2→Deconvolutionlab2Run CIBR点击Choose，将之前保存的8bit的图像和生成的PSF载入，3Ddeconvolution 使用Richardson-Lucysystem，迭代次数N=10,根据数据特点进行迭代次数的选择，注意不要过度迭代（其他算法可以百度其原理，根据数据特点进行使用），最后点击Run。
d)使用最大投影的方式比较处理前后的效果 Zprojection:Image→stacks→Zprojection Projectiontype选择Maxintensity最大投影 原始图像的最大投影 3Dcolordeconvolution 去卷积（N=20）的最大投影 a)先将数据拆分成3个通道image→color→splitchannels，将会得到3个灰度图 CIBR的stack，分别是
R，G，B通道； b)根据荧光的不同发射波长，生成3个理论PSF(
R，G，B)c)然后分别对
R，G，B通道进行deconvolution处理，参照3Dgrey deconvolution步骤； d)处理后，再将
R，G，B处理后的通道合并在一起，image→color→merge channels；注意：不要选择posite选项； 3D去卷积的局限性：
1、可处理数据最大的放大倍数为40×，即40×的物镜，对于100×的物镜的到数据处理 后并不能得到特别锐利的数据，因为我们的显微镜无法实现理想的层切厚度以及相机的解析力(140万像素)不够高。
但是对于2D的数据任何放大倍数都可以使用。

2、去卷积算法对最小分辨率有要求，但是具体的数值没有测试出来；越高的分辨率，计算出的结果越好
3、得到的一个准确的理论PSF对于数据的处理非常重要。
所以我们要确认diffraction3DPSF没有错，尤其是CCDCellSpacing和indexofrefraction两个参数没有错误。
CIBR