PCR手册
单管Assay96或384孔板
384孔TaqMan®ArrayCardOpenArray®芯片
上图显示的为实时荧光定量PCR常用的产品形式。
实时荧光定量PCR基础知识1实验设计2反应板制备3数据分析4疑难解析5数字PCR6 实时荧光定量PCR基础知识
1 实时荧光定量PCR基础知识 1.1简介1.2实时荧光定量PCR概述1.3实时荧光定量PCR组分概述1.4实时荧光定量PCR分析1.5实时荧光定量PCR荧光检测系统1.6熔解曲线分析1.7参比荧光染料1.8污染预防1.9多重实时荧光定量PCR1.10内部质控品和参考基因1.11实时荧光定量PCR仪校准
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4 1
6 10 14 15 16 16 18 19
1 1 实时荧光定量PCR基础知识 1.1简介 聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学领域功能最强大的技术之
一。
采用PCR技术，利用序列特异性寡核苷酸、热稳定性DNA聚合酶和热循环，可将DNA或cDNA模板内的特异性序列拷贝或“扩增”数千至数百万倍。
在传统(终点)PCR中，扩增序列的检测和定量是在反应结束，即最后一次PCR循环完成后进行的，且需要PCR后分析，如凝胶电泳和图像分析。
在实时荧光定量PCR(qPCR)中，每次循环均检测PCR产物。
通过监测指数扩增期的反应，用户可以确定靶点的起始量，且精度极高。
在理论上，PCR可呈指数型扩增DNA，使每个扩增循环中的靶分子数倍增。
在PCR问世之初，科学家推断，通过与已知标准品进行比较，利用循环数和PCR终产物的量可以计算出遗传物质的起始量。
为达到可靠定量的要求，实时荧光定量PCR技术得以问世。
如今终点PCR主要用于扩增特定的DNA，用于测序、克隆及其它分子生物学技术。
在实时荧光定量PCR中，每次循环结束后通过荧光染料检测DNA的量，荧光染料产生的荧光信号与生成的PCR产物分子(扩增片段)数直接成正比。
利用反应指数期采集的数据，生成有关扩增靶点起始量的定量信息。
实时荧光定量PCR使用的荧光报告基团包括双链DNA(dsDNA)结合染料或在扩增过程中掺入PCR产物的、与PCR引物或探针结合的染料分子。
利用具有热循环功能及荧光染料筛查能力的仪器，检测反应过程中荧光的变化。
实时荧光定量PCR仪通过绘制荧光与循环数曲线，生成扩增曲线，表示在整个PCR反应过程中积聚的产物(图1)。
实时荧光定量PCR的优点包括： •能够实时监控PCR反应的进程•能够精确测定每个循环的扩增片段数量，从 而对样本中的起始材料量进行准确定量•具有更大的检测动态范围•在单管中实现扩增和检测，无需PCR后处理 在过去的数年中，实时荧光定量PCR已成为DNA或RNA检测和定量的主要工具。
采用上述技术，您可以实现精确的检测，其准确度低至2倍范围，起始材料的动态范围达6至8个数量级。
起始靶点 相对荧光 基线荧光 荧光阈值 循环数 图
1.相对荧光与循环数。
通过绘制每个样本的荧光信号与循环数曲线，生成扩增曲线；因此，扩增曲线表示在实时荧光定量PCR实验过程中积聚的产物。
用于创建本图曲线的样本是连续梯度稀释的DNA靶序列。
2 实时荧光定量PCR基础知识 1.2实时荧光定量PCR概述 本部分将概括实时荧光定量PCR的步骤。
实时荧光定量PCR是在标准PCR技术基础上演变而成，常用于定量样本中的DNA或RNA。
利用序列特异性引物，可测定特定的DNA或RNA序列的拷贝数。
通过检测PCR循环的每个阶段中扩增产物的量，实现定量。
如果样本中存在高丰度的特定序列(DNA或RNA)，则在早期循环中即可观察到扩增；如果序列较少，则在晚期循环中方可观察到扩增。
利用荧光探针或荧光DNA结合染料，采用实时荧光定量PCR仪检测荧光并完成PCR反应所需的热循环，实现扩增产物的定量。
实时荧光定量PCR的步骤 实时荧光定量PCR反应的每个循环包括三个主要步骤。
一般运行40个循环。
1.变性：利用高温孵育将双链DNA“熔解”为单链，并松开单链DNA的二级结构。
一般采用DNA聚合酶可耐受的最高温度(通常为95°C)。
如果模板GC含量较高，则延长变性时间。
2.退火：在退火过程中，互补序列有机会发生杂交，因此，应根据计算所得的引物熔解温度(Tm)，使用适当的温度(通常较引物的Tm低5°C)。
3.延伸：在70-72°C之间，DNA聚合酶的活性最佳，引物延伸速度达每秒100个碱基。
当实时荧光定量PCR中的扩增片段较小时，通常将该步骤与退火步骤合并，温度为60°
C。
两步法qRT-PCR 两步法定量逆转录PCR(qRT-PCR)的第一步是采用逆转录酶(RT)将总RNA或poly(A)RNA逆转录为cDNA。
采用随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物(GSP)完成第一链cDNA合成反应。
为在实时荧光定量PCR应用中平均表示所有靶点并避免oligo(dT)引物的3’偏差，许多研究人员采用了随机引物或oligo(dT)和随机引物的混合物。
cDNA合成采用的温度取决于所选的RT酶。
逆转录完成后，将约10%的cDNA转移至单独的管中，完成实时荧光定量PCR反应。
一步法qRT-PCR 一步法qRT-PCR可在同一管内完成第一链cDNA合成反应和实时荧光定量PCR反应，简化了反应设置，并降低了污染的可能性。
需要使用基因特异性引物(GSP)。
这是由于在一步法操作中使用oligo(dT)或随机引物将生成非特异性产物，降低了目的产物的量。
1 3
1 实时荧光定量PCR基础知识 1.3实时荧光定量PCR组分概述 本部分将概括实时荧光定量PCR实验的主要反应组分和参数。
在本手册后面的部分，将更详细地介绍一些特殊的组分，如报告基团染料、参比荧光染料和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。
DNA聚合酶 PCR的性能通常与热稳定性DNA聚合酶有关，因此酶的选择是反应成功的关键。
影响PCR特异性的一个主要因素是TaqDNA聚合酶在低温下具有残留活性。
在反应的设置中，引物可与DNA非特异性地退火结合，使得聚合酶合成非特异性产物。
通过采用“热启动”酶，可最大程度地减少因引物错配形成非特异性产物的问题。
采用热启动酶确保了在反应设置过程和初始DNA变性步骤中，DNA聚合酶无活性。
逆转录酶 逆转录酶(RT)同DNA聚合酶一样，亦是qRT-PCR成功的关键。
选择一种不仅能够提供高全长cDNA产量且在高温下具有良好活性的RT至关重要。
高温性能对于具有二级结构的RNA的变性同样极为重要。
在一步法qRT-PCR中，可在较高温度下维持活性的RT使您能够使用具有高熔解温度(Tm)的GSP，提高了特异性，降低了背景。
dNTP 最好从同一供应商那里购买dNTP和热稳定性DNA聚合酶，因为在实验中使用不同供应商的试剂，常常会出现阈值循环(Ct)灵敏度下降的情况。
镁离子浓度 在实时荧光定量PCR中，氯化镁或硫酸镁的终浓度一般为3mM。
这是大多数靶点的最佳工作浓度；但镁离子的最佳浓度范围为3至6mM。
良好的实验技术 不要低估良好的实验技术的重要性。
反应的每个阶段(从模板制备到PCR后分析)最好使用专门的设备和解决方案。
使用防气溶胶吸头和螺帽管有助于减少交叉污染问题。
要获得严格的重复数据(理论上为三次重复)，需制备包含除样本外的所有反应组分的预混液。
使用预混液可减少加样步骤，从而降低孔间污染及其它加样误差的几率。
模板 每次实时荧光定量PCR反应需使用10至1,000拷贝的模板核酸。
这相当于大约100pg至1μg的基因组DNA或利用1pg至100ng总RNA生成的cDNA。
多余的模板也可能提高污染物含量，大大降低PCR效率。
PCR引物的特异性针对cDNA而非基因组DNA，处理RNA模板以降低其包含基因组DNA污染的几率十分重要。
一种方案是采用DNA酶I处理模板。
纯的完整RNA是高质量全长cDNA合成的基础，也是实现准确的mRNA定量的关键。
RNA应避免RNA酶污染，且应维持无菌状态。
总RNA一般适用于qRT-PCR；通常无需mRNA提取，但提取mRNA可提高特定cDNA的产量。
4 实时荧光定量PCR基础知识 实时荧光定量PCR引物设计 良好的引物设计是实时荧光定量PCR的最重要参数之
一。
这正是众多研究人员选择购买TaqMan®Assay产品的原因——这些引物和探针采用了成熟可靠的算法设计，获得了全世界科学家的信赖，适用于实时荧光定量PCR。
如果您选择设计您自己的实时荧光定量PCR引物，切记扩增片段的长度应约为50–150bp，因为较长的产物无法实现高效扩增。
一般而言，引物的长度应为18–24个寡核苷酸。
这是针对实际的退火温度的。
引物应根据标准PCR指南设计。
它们对于目的基因序列应是特异性的，且无内部二级结构。
引物应不含共聚物延伸段序列(如poly(dG))或重复基序，因其可引起不必要的杂交。
引物对应具有相当的熔解温度(在1°C以内)，且GC含量约为50%。
高GC含量的引物可形成稳定的不良杂合体。
相反，高AT含量会降低匹配良好的杂合体的Tm值。
如果可能，引物的3’端应具有高GC含量(GC夹)，以提升延伸端的退火效率。
分析引物对序列，避免引物之间的互补和杂交(引物二聚体)。
在qRT-PCR中，设计内含子两侧可与外显子退火结合的引物(或覆盖mRNA相邻两个外显子交界处)，利用熔解曲线分析区分cDNA和潜在污染基因组DNA的扩增。
要确认引物的特异性，可在公共数据库上进行BLAST搜索，以确保您的引物只识别目的靶点。
想获得最佳结果，需要在50至500nM浓度间进行引物滴定。
引物终浓度为200nM时能有效地进行大多数的实验。
引物设计软件 引物设计软件程序(如OligoPerfect™设计工具和PrimerExpress®软件)及序列分析软件(如VectorNTI®软件)可自动评估目的序列，并根据上述标准设计序列引物。
使用引物设计软件至少可以确保引物针对目的序列的特异性，且不会形成内部二级结构，并能避免每条引物的3’端自身或与其它引物之间形成互补杂交。
如前所述，在使用DNA结合染料进行扩增片段检测时，良好的引物设计尤为关键。
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1 实时荧光定量PCR基础知识 1.4实时荧光定量PCR分析 本部分定义了实时荧光定量PCR分析中常用的术语。
基线 实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中(一般为第3至15个循环)的信号水平，此阶段的荧光信号变化极小。
低水平的基线信号相当于反应的背景或“噪声”(图2)。
每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析，根据经验确定。
应仔细设置基线，以准确确定阈值循环(Ct)(定义如下)。
基线确定应考虑足够的循环数，消除扩增早期的背景，但应排除扩增信号开始超过背景的循环。
当比较不同的实时荧光定量PCR反应或实验时，应采用同样的方法确定基线(图2)。
标准曲线 利用连续稀释的已知样本建立标准曲线，确定实验样本的目的模板起始量，或者评估反应效率(图4)。
以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标(x轴)，该浓度对应的Ct值为纵坐标(y轴)，绘制曲线。
从该标准曲线中可以推导出反应性能及各种反应参数(包括斜率、y截距和相关系数)相关的信息。
标准曲线中所选的浓度应涵盖实验样本的预期靶点浓度范围。
阈值 实时荧光定量PCR反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加(图2)。
设置阈值可将相关扩增信号从背景中区分出来。
实时荧光定量PCR仪软件通常将阈值自动设置为基线荧光值标准差的10倍。
但阈值可设置在PCR指数期的任意点。
Ct(阈值循环) 阈值循环(Ct)是反应的荧光信号与阈值交叉的循环数。
Ct值可用于计算起始DNA拷贝数，因为Ct值与起始靶点量呈反比。
例如，比较含有不同靶点量的样本的实时荧光定量PCR结果时，如果第一个样本扩增前起始的靶基因拷贝数是后一个样本的两倍，较之第二个样本，第一个样本可提早一个循环生成Ct(图3)。
前提是上述两个反应的PCR的工作效率均为100%(即每个循环后产物量均实现倍增)。
模板量越低，出现明显扩增的循环数越高。
模板按10倍稀释，则Ct值递减3.3个循环。
阈值 基线 循环数 图
2.实时荧光定量PCR反应的基线和阈值。
图3.10倍连续稀释的扩增曲线。
6 实时荧光定量PCR基础知识 图
4.实时荧光定量PCR数据的标准曲线示例。
标准曲线的y轴表示阈值循环(Ct)，x轴表示起始RNA或DNA靶点量。
斜率、y-截距和相关系数值可用于提供反应性能相关的信息。
相关系数(R2) 相关系数可用于表示数据与标准曲线之间的契合度。
R2值反映了标准曲线的线性度。
在理论上，R2=
1，但0.999一般为最大值。
Y-截距 y-截距表示反应的理论最低检测限，或者x轴上的最低拷贝数的靶分子产生明显扩增时的预期Ct值。
尽管PCR在理论上能够检测单拷贝靶点，但在实时荧光定量PCR应用中能可靠定量的最低靶点量通常为2–10拷贝。
这限制了y-截距值直接反映灵敏度的作用。
但y-截距值可用于比较不同的扩增系统和靶点。
指数期 在指数期的早期，而不是指数期的晚期或反应达到平台时进行实时荧光定量PCR反应定量十分重要。
在指数期的开始，所有试剂仍有剩余，DNA聚合酶仍然高效，扩增产物的量较少，不会竞争引物的退火性能。
所有这些均可提高数据的准确度。
斜率 扩增反应的对数线性期的斜率可用于检测反应效率。
要获得准确且可重复的结果，反应效率应尽可能接近100%，相当于斜率为-3.32(参见下文效率，了解更多详情)。
效率 100%的PCR效率对应的斜率为-3.32，可根据下列等式确定： 效率=10(-1/斜率)-
1 理论上，PCR反应的效率(E)应为100%，表示在指数扩增阶段每次热循环后的模板倍增。
实际效率可提供反应相关的重要信息。
诸如扩增片段的长度、二级结构和GC含量等实验因素会影响效率。
影响效率的其它条件有反应本身的动态范围、使用的试剂浓度未达到最佳以及酶的质量，这些因素均会导致效率低于90%。
一种或多种试剂中存在的PCR抑制剂可使其效率超过110%。
良好的反应效率应在90%至110%之间，其对应的斜率为-3.58至-3.10。
动态范围 在此范围内，起始材料的浓度增加，扩增产物也相应增加。
理论上，质粒DNA的实时荧光定量PCR的动态范围应为7-8个数量级，cDNA或基因组DNA至少为3–4log范围。
绝对定量 绝对定量是指在实时荧光定量PCR实验中，对已知量的样本进行连续稀释后扩增，生成标准曲线。
然后通过与此曲线比较，定量未知样本。
相对定量 相对定量是指在实时荧光定量PCR实验中，将一个样本(已处理)中的目的基因表达与另一个样本(未处理)中相同基因的表达相比较。
结果以处理样本的表达量相对于未处理样本表达量的倍数变化(增加或减少)表示。
此类型的定量采用标准品基因(如β-actin)作为实验差异对照品。
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1 实时荧光定量PCR基础知识 熔解曲线(解离曲线) 熔解曲线图示了随着反应温度的升高，当结合染料分子的双链DNA(dsDNA)解离或“熔解”成单链DNA(ssDNA)时，观察到的荧光强度的变化。
例如，当加热结合有SYBR®GreenI染料的双链DNA时，其达到熔点(Tm)后，由于DNA链的解离和染料的释放，检测的荧光强度会出现突然下降。
绘制荧光强度与温度图(图5A)，及-ΔF/ΔT(荧光变化/温度变化)与温度图，清晰显示熔解曲线动态范围(图5B)。
扩增后熔解曲线分析是一种简单、直接地检查实时荧光定量PCR反应中引物二聚体结构的方法，可确保反应的特异性。
由于核酸的熔解温度受长度、GC含量以及是否存在碱基错配等因素影响，不同的PCR产物通常可根据其熔解特性区分。
通过熔解曲线分析鉴定反应产物(如引物二聚体与扩增片段)省去了耗时的凝胶电泳步骤。
图6所示的典型的实时荧光定量PCR数据组显示了上文提及的多个术语。
图6A显示了典型的实时荧光定量PCR扩增曲线。
在早期PCR反应循环中，荧光信号变化极小。
随着反应的进行，每个循环的荧光水平开始增加。
将反应阈值设置在基线之上、曲线的指数期部分。
该阈值可用于指定每个扩增反应的阈值循环或Ct值。
利用一系列含有已知量靶点的反应的Ct值生成标准曲线。
将未知样本的Ct值与此标准曲线相比较进行定量，或者在相对定量时采用标准曲线检验效率。
Ct值与起始模板量呈反比：反应中的起始模板量越高，反应的Ct值越低。
图6B显示了利用扩增曲线的Ct值生成的标准曲线。
标准曲线提供了扩增效率、重复一致性及反应的理论检测限等信息
A.B.图
5.熔解曲线(A)和-ΔF/ΔT与温度(B)。
8 实时荧光定量PCR基础知识
A. 1
B. 图6.1.25x103至2x104个拷贝的RNA酶P扩增。
在ViiA™7实时荧光定量PCR系统的标准热循环条件下，采用FAM™染料标记的TaqMan®Assay及TaqMan®UniversalMasterMixII对2倍连续稀释的人RNA酶PDNA进行实时荧光定量PCR反应。
(A)扩增曲线。
(B)标准曲线显示了模板拷贝数与阈值(Ct)。
9 1 实时荧光定量PCR基础知识 1.5实时荧光定量PCR荧光检测系统 实时荧光定量PCR化学原理 实时荧光定量PCR试剂的种类很多，但最常用的是5’核酸酶Assay，例如TaqMan®Assay和基于SYBR®Green染料的Assay(图7)。
5’核酸酶Assay以TaqDNA聚合酶的5’核酸酶活性命名(图8)。
5’核酸酶结构域能够在DNA合成结束后，降解与模板结合的DNA。
5’核酸酶Assay的第二个关键元件是一种称为FRET的现象：荧光共振能量转移(fluorescentresonanceenergytransfer，FRET)。
在FRET中，邻位的另一种染料——通常被称为淬灭剂——可大大降低荧光染料的发射信号。
可通过两种荧光染料对FRET进行图示说明：绿色和红色(图9)。
绿色荧光染料的发射光能量较红色荧光染料更高，这是由于绿光的波长比红光短。
如果红色染料邻近绿色染料，则激发绿色染料将导致绿光的发射能量被转移至红色染料上。
换言之，能量从高处转移至低处。
继而绿色染料的信号将被抑制或“淬灭”。
但如果两种染料相距较远，则不会出现FRET现象，绿色染料能发射出全部信号。
用于靶点检测或定量的5’核酸酶Assay通常包括两个PCR引物和一个TaqMan®探针(图10)。
在PCR开始之前，TaqMan®探针完整且具有一定的灵活性。
探针完整时，报告基团和淬灭剂之间具有天然的亲和力，可促进FRET的发生(图11)。
在PCR开始之前，报告基团信号被淬灭。
在PCR过程中，引物和探针与靶点退火结合。
DNA聚合酶延伸探针上游的引物。
如果探针与正确的靶序列结合，则聚合酶的5’核酸酶活性会切断探针，释放出含有报告基团染料的片段。
剪切完成后，报告基团和淬灭染料不再相互吸引；释放的报告基团分子将不再被淬灭。
图7.5’核酸酶Assay。
图
8.TaqDNA聚合酶图示。
每个不同颜色的球表示一个蛋白质结构域。
图
9.FRET现象举例。
(A)当绿色荧光染料与红色荧光染料靠近时可出现FRET。
(B)当两种荧光染料相距较远时，不会出现FRET。
5’核酸酶Assay特异性 Assay特异性是指Assay结果中包括靶点信号且排除非靶点信号的程度。
特异性可以说是任何一个Assay中最重要的方面。
影响5’核酸酶Assay特异性的最重要因素是同源物。
同源物是与靶点序列相似的基因，但不是Assay的目的靶点。
同源物在种属内部及相关种属之间极为常见。
10 实时荧光定量PCR基础知识 图10.TaqMan®探针。
TaqMan®探针具有基因特异性序列，可与两个PCR引物之间的靶点结合。
TaqMan®探针的5’端带有“报告基团”，该荧光染料将报告靶点的扩增。
探针的3’端为淬灭剂，它可以淬灭完整探针中报告基团发出的荧光。
淬灭剂还将阻断探针的3’端，这样即无法在热稳定性DNA聚合酶作用下延伸。
图11.TaqMan®探针图示。
R为报告基团染料，Q为淬灭剂分子，橙色的线条表示核苷酸。
1 5’核酸酶Assay提供了两种特异性工具：引物和探针。
靶点与同源物之间的错配发生在引物的3’最末端的碱基对引物的特异性影响最大，而远离3’末端的错配对特异性影响较小。
而发生在TaqMan®MGB探针(较TaqMan®TAMRA™探针短)大部分位置上的错配对特异性的影响极大——TaqMan®MGB探针是比引物更有效的实现特异性工具。
例如，引物结合位点上的一个或两个碱基的随机错配将极有可能使DNA聚合酶高效延伸与同源物结合的引物。
DNA聚合酶作用下的一个或两个碱基的延伸将稳定与同源物结合的引物，因此其结合的稳定性同引物与完全互补的目的靶点的结合相当。
此时，DNA聚合酶将继续合成，生成同源物的拷贝。
在TaqMan®探针3’端的淬灭剂的作用下，DNA聚合酶无法稳定5’端的错配。
TaqMan®MGB探针结合位点上的错配将降低探针结合的紧密度，这样探针不会被剪切，而是整个探针被置换。
整个探针回到其淬灭结构，当PCR循环结束采集数据时，信号由靶点而非同源物产生，即便同源物亦扩增，也不会产生信号。
除同源物外，PCR还可扩增非特异性产物，这是引物与样本DNA的随机位点结合或者引物自身结合(称为“引物二聚体”)产生的。
由于非特异性产物与靶点无关，因此它们无TaqMan®探针结合位点，在实时荧光定量PCR数据中不可见。
TaqMan®探针类型 TaqMan®探针可分为两种类型：MGB和非MGB。
第一款TaqMan®探针属于“非MGB”。
它们采用TAMRA™染料作为淬灭剂。
在实时荧光定量PCR发展的早期，大量测试显示，TaqMan®探针所需的退火温度远高于PCR引物的温度，因而无法完成剪切。
因此，TaqMan®探针的长度要大于引物。
这种长探针上出现一个碱基错配对探针结合的影响相对较小，可完成剪切。
但对于很多遗传复杂性较高的应用领域，如真核基因表达和单核苷酸多态(Singlenubleotidepolymorphisms，SNP)，则需要更高的特异性。
TaqMan®MGB探针是在TaqMan®探针技术基础上进一步改良而成的。
TaqMan®MGB探针的3’端带有小沟结合物(MGB)分子。
探针与靶点结合后，DNA内形成较短的小沟，使MGB分子结合，提高了熔解温度；从而增强了探针的结合。
TaqMan®MGB探针的长度可以大大短于PCR引物。
由于MGB基团的存在，这些探针可以较TaqMan®探针更短，同时能够达到较高的熔解温度。
与引物相比，TaqMan®MGB探针能在更高的温度下，与靶点更特异性地结合。
TaqMan®MGB探针更短，一个碱基的错配对其结合的影响更大。
由于TaqMan®MGB探针具有更高的特异性，因此其被推荐用于大多数遗传复杂性高的应用领域。
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1 实时荧光定量PCR基础知识 TaqMan®探针信号产生 无论您选择MGB还是非MGB探针，其信号图谱均相同。
在早期PCR循环中，只能检测到较低的淬灭报告基团信号。
在实时荧光定量PCR软件中，这些早期数据被自动消减为零，称为“基线”。
如果样本含有靶点，则最后将生成足够量的剪切探针，使扩增信号高于基线。
扩增信号变得可见的时间点与初始靶点量呈反比。
SYBR®Green染料 SYBR®GreenI染料是一种荧光DNA结合染料，可与双链DNA的小沟结合。
激发与DNA结合的SYBR®Green染料可产生较未结合染料更强的荧光信号。
基于SYBR®Green染料的Assay一般包括两个PCR引物。
在理想状态下，SYBR®GreenAssay的扩增图谱与基于TaqMan®探针的Assay类似。
在早期PCR循环中，可观察到水平基线。
如果样本中存在靶点，则在某个时间点将生成足够的PCR产物，使扩增信号变得可见。
SYBR®GreenAssay的特异性 Assay特异性测试对所有Assay都十分重要，尤其是那些容易遇到特异性问题的Assay。
SYBR®GreenAssay不具有TaqMan®探针的特异性，因此更容易出现特异性问题。
SYBR®Green染料将与扩增产物、靶点或非靶点结合，所有这些信号经过汇总后可生成一条扩增曲线。
SYBR®Green扩增曲线的形状无法用于特异性评估。
不论扩增的是靶点、非靶点还是混合物，曲线外观几乎相同。
SYBR®GreenAssay产生的扩增不应被理解为大部分信号源自靶点。
不同样本之间的非靶点扩增有所差别，每个SYBR®Green反应都应完成至少一种类型的特异性评估。
最常用的评估是解离分析。
SYBR®Green染料解离 SYBR®Green解离是采用SYBR®Green完成PCR反应后，PCR产物逐渐熔解。
解离是一种极佳的特异性评估方法，它无需额外的实验成本，在PCR反应容器内即可进行。
但解离延长了热循环实验方案，需要额外的分析时间，同时具有一定的主观性，且分辨率有限。
SYBR®Green解离的概念是，如果靶点是一个确定的基因序列，则应具有一个特定的熔解温度(Tm)，可用于帮助样本中的靶点鉴别。
一些非靶点产物的Tm值与靶点相差较大，从而实现了非靶点扩增的检测。
在最后的PCR循环完成后，增加解离实验方案。
完成熔解过程后，实时荧光定量PCR软件将绘制数据的一阶导数的负值，使熔解曲线变为单峰。
靶点峰的准确鉴别取决于纯靶点的扩增。
很多样本(如RNA和基因组DNA)具有较高的遗传复杂度，有利于非靶点的扩增，同时抑制了靶点扩增，在某些情况下甚至改变了熔解峰的形状。
研究人员采用纯的靶点作为起始材料，能够在扩增后将Tm峰和形状与特定的靶点相关联。
应只观察到单峰。
假定靶点峰应窄而对称，无不规则形状，如肩、驼峰或分割。
这些不规则的形状说明生成了Tm值相当的多个产物，使人对反应的特异性产生怀疑。
出现不规则解离的孔应从进一步分析中省去。
SYBR®Green解离的分辨率较低，且无法区分Tm值相当的靶点和非靶点，如同源物。
因此窄而对称的单峰不应确定为靶点或者某种产物，需额外的支持信息。
应评估每个可以观察到扩增的孔的解离数据。
如果样本中包含的峰无法对应纯的靶点峰，则结论是反应中未检测到靶点。
如果样本中包含的峰似乎与Tm值及纯靶点峰的形状匹配，则反应中可能有靶点扩增。
利用单独的解离曲线无法获得确定的结果，但当其与其它信息相结合(如阴性靶点样本、序列或凝胶)，则可提高特异性的可信度。
12 实时荧光定量PCR仪 实时荧光定量PCR仪有许多不同的模式。
每种模式必须有一个用于激发荧光染料的激发光源，及用于检测荧光发射值的检测器。
此外，每种模式还必须有一台PCR仪。
热循环模块可以是固定的(如StepOnePlus®系统)，也可以是用户可更换的(如ViiA™7系统、QuantStudio™6和7Flex系统、QuantStudio™12KFlex系统)。
有多种模块可供选择，能够容纳各种PCR反应容器：48孔板、96孔板、384孔板、384微孔Card、3072通孔反应板等。
所有的实时荧光定量PCR仪均附带软件，用于数据采集和分析。
染料区分 大多数实时荧光定量PCR反应含有多种染料，包括一个或多个报告基团染料，有时包括淬灭剂染料，以及极为常用的参比荧光染料。
同一个孔内的多个染料可以单独检测，亦可通过优化的激发光和发射光滤光片组合或者一种称为多组分算法的过程检测。
多组分算法是一种检测反应中每种染料的染料强度的数学方法。
多组分算法具有诸多优点，它可轻松校正染料指示错误，无需硬件调整即可将光学性能恢复至出厂标准，并提供了疑难排除信息来源。
实时荧光定量PCR基础知识
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1 实时荧光定量PCR基础知识 1.6熔解曲线分析 熔解曲线分析和检测系统 熔解曲线分析只适用于扩增片段上保留荧光基团的实时荧光定量PCR检测技术。
采用SYBR®GreenI或SYBR®GreenER™染料的扩增可进行熔解曲线分析。
双重标记探针检测系统(如TaqMan®探针)不适用，因为该系统可在PCR过程中剪切并释放荧光基团至溶液中，产生不可逆的信号变化；但该方法具有更高的特异性，因此不会带来严重的影响。
SYBR®GreenI和SYBR®GreenER™染料与dsDNA结合后，荧光水平大幅增加。
通过监测dsDNA的熔解将会观察到，随着DNA变为单链且染料从DNA上解离，荧光强度逐渐下降。
熔解曲线分析的重要性 实时荧光定量PCR分析的特异性取决于使用的引物及反应条件。
但即便是设计极佳的引物亦可能形成引物二聚体或扩增出非特异性产物(图12)。
当包含基因组DNA的RNA样本进行qRT-PCR时，基因组DNA也有可能被扩增。
可采用熔解曲线分析确认实时荧光定量PCR反应的特异性。
当无法进行熔解曲线分析时，必须更加注意不同反应之间观察到的Ct值差异是否有效，且不是由于存在非特异性产物造成的。
熔解曲线分析和引物二聚体 当两个PCR引物(同义引物或正义和反义引物)相互结合，而非与靶点结合时，即形成引物二聚体。
引物二聚体的熔解温度较扩增片段更低，采用熔解曲线分析可鉴别是否存在引物二聚体。
包含模板的样本中最好无引物二聚体存在，因其会降低PCR效率并影响分析。
无模板对照(NTC)中最易形成引物二聚体，因其中包含大量的引物且无模板存在。
NTC中存在引物二聚体时，用户应注意包含模板的反应中也可能有引物二聚体存在。
如果NTC中存在引物二聚体，则应重新设计引物。
对NTC的熔解曲线分析，可以将引物二聚体与由试剂组分中污染的核酸造成的假性扩增区分开来。
如何进行熔解曲线分析 要进行熔解曲线分析，应对实时荧光定量PCR仪进行编程，在热循环实验方案结束后显示熔解曲线。
扩增完成后，仪器将重新加热您的扩增产物，为您提供完整的熔解曲线数据(图13)。
大多数实时荧光定量PCR仪平台已将该特性整合至其分析软件包内。
图12.熔解曲线分析可用于检测是否存在非特异性产物(如引物二聚体)，如图所示，熔解曲线中扩增产物峰的左侧有其它的峰。
图13.AppliedBiosystems®仪器上的熔解曲线热学特性设置示例(快速加热至94°
C，变性DNA，然后冷却至60°C)。
14 实时荧光定量PCR基础知识 1.7参比荧光染料 在实时荧光定量PCR中，参比荧光染料常用于报告基团染料荧光信号的标准化，以及非PCR相关的荧光波动的校正。
需要通过标准化校正反应浓度或体积变化引起的孔间波动，并校正仪器扫描差异。
大多数实时荧光定量PCR仪采用ROX™染料作为参比荧光染料，这是因为ROX™染料不会对实时荧光定量PCR反应产生影响，且可将其荧光信号与其它报告基团或淬灭染料区分开来。
其中的例外是Bio-RadiCycleriQ®仪器系统，它采用荧光素作为参比荧光染料。
参比荧光染料 基于ROX™染料的参比荧光染料可用于其兼容的仪器(如AppliedBiosystems®仪器)上的实时荧光定量PCR中荧光报告基团信号的标准化。
使用参比荧光染料可高效实现荧光报告基团信号的标准化，且无需修改仪器的默认分析参数。
TaqMan®实时荧光定量PCR预混液中含有参比荧光染料，可作为内部参照用于： •非PCR相关的荧光波动的标准化(例如由加样误差引起的) •机器“噪声”引起的荧光波动的标准化•仪器激发和检测差异补偿•为多重实时荧光定量PCR和qRT-PCR提供稳定的 基线 荧光素参考染料 Bio-RadiCycler®仪器需要在每次运行之前采集“孔间差异因子”，补偿仪器或加样的不一致性。
采用SYBR®GreenI或SYBR®GreenER™染料进行的实验，需利用其它荧光基团——荧光素——来计算孔间差异因子。
采用每孔含有荧光素染料的单独的反应板(外部孔间差异因子)，或者将荧光素加入实时荧光定量PCR预混液中进行反应板内部校正(动力学孔间差异因子)，采集孔间差异因子。
当您每次采用iCycler®仪器开始运行前，必须选择方法。
iCycler®iQ™5和MyiQ™系统可将外部孔间差异因子读数数据保存为单独的文件，供后续读数参考。
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1 实时荧光定量PCR基础知识 1.8污染预防 与传统PCR一样，实时荧光定量PCR反应也受到核酸污染，从而导致假阳性结果。
可能的污染源有： •样本间的交叉污染•实验室设备的污染•前次PCR扩增产物和引物残余污染。
这是假阳性 PCR结果的主要来源 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG) 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)可通过防止前次反应的DNA的扩增，减少或阻止PCR反应之间的DNA残余污染。
在PCR反应中使用UDG可减少假阳性，从而提高实时荧光定量PCR反应的效率和数据的可靠性。
UDG防止残余污染的原理 UDG防止残余污染源于在实时荧光定量PCR预混液中采用dUTP替代dTTP。
然后再用UDG处理后续的实时荧光定量PCR反应预混液，降解污染的含有尿嘧啶的PCR产物，保留天然(含有胸腺嘧啶)的靶DNA模板。
采用标准UDG，先在50°C下短暂孵育，然后进行PCR热循环，使酶能够剪切污染DNA中的尿嘧啶残基。
去除尿嘧啶碱基可引起DNA断裂，防止其在PCR中用作模板。
UDG随后在PCR中升温至95°C灭活。
我们还可提供热不稳定性酶，它在50°C下即可灭活，适用于一步法qRT-PCR反应预混液。
1.9多重实时荧光定量PCR 多重反应简介 PCR多重反应是指在同一个反应中实现两个或更多基因序列的扩增和特异性检测。
要获得成功，PCR多重反应必须能够生成针对目的序列的足够的扩增产物。
多重实时荧光定量PCR可同时产生定性和定量的结果。
对于定量多重PCR，所有的目的序列的扩增必须能产生足够的几何期即对数期的信号。
对于定性结果，如果扩增产物足够，也可利用终点检测方法(如凝胶电泳)检测所有目的序列。
实时荧光定量PCR多重反应可用于生成定性或定量结果。
要完成实时荧光定量PCR多重反应，所有目的序列都必须生成足够的几何相信号。
后缀“plex”可用于多个术语。
单重(Singleplex)反应是一种旨在扩增单个基因序列的分析。
双重(Duplex)反应是两个PCR反应的组合，旨在同时扩增两个基因序列。
多重反应最常见的类型是双重反应，它是在同一孔内进行靶基因和对照或标准品基因序列分析；多于两重的更多重的反应也是可实现的。
一些商品化的实时荧光定量PCR试剂盒就是作为多重反应进行设计和验证的。
例如，MicroSEQ®
E.ColiO157:H7试剂盒采用了内部阳性对照和大肠杆菌靶点多重反应。
在研究应用领域，通常由科学家来选择采用哪种多重反应分析，并负责多重反应的验证。
在考虑是否建立多重反应分析时，权衡多重反应与所需的验证工作的利弊至关重要。
多重反应的优点 多重反应的三个优点：更高的通量(每块反应板可分析更多样本)、更低的样本用量和试剂用量——取决于实验中的靶点数。
例如，如果定量实验中只包括一个靶点分析，在同一反应中加入标准品分析，如内参，进行双重反应靶点分析将提高2倍的通量，同时每个样本减少一半的样本用量和试剂用量。
但如果定量实验包括两个靶点分析，可将两个靶点反应与一个标准品反应组合成三重反应。
在这种情况下，样本用量和试剂用量将进一步降低。
16 实时荧光定量PCR基础知识 如果同时进行靶点和标准品多重反应，则多重反应还具有另一个优点——使加样精度错误最小化。
同一孔的靶点和标准品数据来源于一次加样，因此任何加样精度错误应对靶点和标准品结果具有同等影响。
为获得精度优势，必须采用同一孔的标准品数据对靶点数据进行标准化，然后计算技术重复的精度。
比较利用单重反应方式分析的数据(未经过基于孔的标准化)与利用多重反应方式完成的分析，证明多重反应的精度优势较大，具体取决于单重反应的错误。
例如，对于单重反应精度错误极少的样本，多重反应的精度优势也微乎其微。
对于需要更高精度的定量实验，多重反应的精度优势显得尤为重要。
例如，在拷贝数变异实验中，区分1拷贝基因与2拷贝基因是2倍差异，需要良好的精度。
但区分2拷贝基因与3拷贝基因仅为1.5的差异，这需要更高的精度。
对于此类型的实验，推荐采用多重反应方法，其有助于达到该实验所需的精度。
多重反应仪器 多重反应分析通常需要在同一孔内加入多种染料。
实时荧光定量PCR仪必须能够准确地检测同一孔内的不同染料信号。
这些测量必须保持针对各染料的特异性，即便当一种染料信号明显高于其它信号时。
多重反应试剂推荐 实时荧光定量PCR多重反应的最佳荧光试剂是那些可以指定不同染料来检测多重反应中的各个基因序列的试剂。
绝大多数多重分析采用了多种染料、高特异性的试剂，如基于TaqMan®探针的Assay。
对于RNA多重反应分析，我们一般推荐两步法RT-PCR，而非一步法RT-PCR。
一步法RT-PCR要求逆转录和PCR的引物浓度相同，降低了多重反应引物浓度的灵活性。
而在两步法RT-PCR中，可对PCR引物浓度进行多重反应优化，且不会影响逆转录。
多重反应的染料选择 假定采用的是多染料实时荧光定量PCR荧光试剂，则多重反应中各种基因序列的检测将需要不同的报告基团染料。
同一孔内的报告基团染料必须被实时荧光定量PCR 仪充分激发并准确检测。
仪器生产商应能够提供推荐染料。
请注意，AppliedBiosystems®实时荧光定量PCR预混液中包含一种红色的参比荧光染料。
仅带有蓝色激发光的仪器可充分激发基于ROX™染料的参比荧光染料，但蓝色激发光一般不足以激发用作报告基团的红色染料。
无需根据靶基因或基因产物的类型指定报告基团染料，但遵循染料的指定模式可简化多重分析的构建。
例如，FAM™染料是TaqMan®探针中最常用的报告基团染料。
我们遵循其模式指定FAM™染料作为靶点分析的报告基团染料，并指定VIC®染料作为标准品分析的报告基团染料。
采用此模式，可通过将不同的FAM™染料标记的靶点分析与相同的标准品分析VIC®染料进行配对，构建多个双链分析。
进行三重分析时，可将第三种染料ABY®或JUN®染料与FAM™染料和VIC®染料相结合。
请注意，如使用ABY®染料，则在同一孔内不应有TAMRA™染料存在，如果使用JUN®染料，MUSTANGPURPLE®应该作为参考标准取代ROX™染料。
多重反应PCR饱和 多重反应PCR饱和是当丰度更高的基因扩增使热稳定性DNA聚合酶饱和时，多重分析中可能出现的不良现象，它抑制了较低丰度基因的扩增。
饱和的补救措施是减少丰度更高的靶点的PCR引物的浓度，称为“引物限制”。
引物限制的浓度应足够实现几何扩增，但需在PCR产物聚集到遏制较低丰度靶点扩增之前使引物耗竭。
计划多重分析时，研究人员应根据PCR反应中各基因和基因产物的DNA或cDNA绝对丰度，识别多重反应中哪种基因或哪些基因有可能引起饱和。
为此我们列出了三种最常见的双链情景。
双重反应情景
1 在这个最常见的情景中，所有样本中丰度更高的基因或基因产物均相同。
仅丰度更高的靶点分析需要引物限制。
例如，标准品可能是18S核糖体RNA，其占真核细胞总RNA的20%。
每个样本中18SrRNAcDNA的丰度高于任意mRNAcDNA。
因此仅18S分析需要引物限制。
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1 实时荧光定量PCR基础知识 双重反应情景
2 在本情景中，两个基因在所有样本中的丰度几乎相同。
一般而言，两种基因的Ct差异为3或者更高，假定阈值相同，则认为两个基因的丰度不同。
基因组DNA应用领域(如拷贝数差异)最可能出现此情景。
情景2无需引物限制，因为两种基因几乎同时经历几何扩增期。
双重反应情景
3 在本情景中，基因或基因产物的丰度明显高于其它。
此时，两种分析均应为引物限制。
多重反应引物相互作用 影响多重分析性能的另一个潜在威胁是不同分析的引物间不必要的相互作用。
引物相互作用的风险会随反应中分析数目的增加而提高，因为随着多重反应分析数的增加，出现的引物对的数目会随之大幅增加。
例如，在包含4个PCR引物的双重反应分析中，可能有6种不同的PCR引物对，在包含6个PCR引物的三重分析中，则可能有15种不同的PCR引物对。
在单重反应中，每个分析可能都运行得很好，但在多重反应中，引物的相互作用可形成竞争产物，抑制扩增的进行。
当多重反应分析具有同源性时，引物相互作用的几率会提高。
如果基于单重反应与多重反应的Ct值存在明显差异的观察得出存在引物的相互作用的现象，则补救措施是对之前的多重反应的实验采用不同的Assay进行。
1.10内部质控品和参考基因 实时荧光定量PCR已成为一种可选的基因表达分析方法。
要利用实时荧光定量PCR获得所选基因的准确且可重复的表达图谱分析，使用可靠的内部对照基因产品对不同实验的表达水平进行标准化至关重要——通常采用看家基因的表达产物。
被选为内部标准品(或内源性对照)的靶点的表达水平应与实验基因产物大致相当。
使用内源性对照作为主动参考，可在mRNA靶点定量时对每个反应中加入的总RNA量差异进行标准化。
无论选择哪个基因作为内源性对照，都必须在各种实验条件下对其进行测试，以确保对照基因在所有条件下均能稳定表达。
采用看家基因进行相对基因表达分析 当所选的看家基因的表达水平保持恒定时，可达到最佳的相对基因表达比较效果。
BioTechniques29:332(2000)和JMolEndocrinol25:169(2000)上的几篇文章论述了看家参考基因的选择。
理论上，所选的看家基因的表达水平应经过各种靶细胞或组织类型验证，以确认其在实验过程中保持恒定。
例如，在增殖细胞中GAPDH会出现表达上调，18S核糖体RNA(rRNA)无法代表全部细胞mRNA群。
18 实时荧光定量PCR基础知识 1.11实时荧光定量PCR仪校准 准确的校准是实时荧光定量PCR仪达到最佳性能的关键。
它可长时间保护数据的完整性和一致性。
实时荧光定量PCR仪应定期校准，在第一次使用新染料之前，亦须遵循生产商的说明进行校准。
激发/发射光差异校正 实时荧光定量PCR仪的光学元件可分为两大类：激发光源(如卤素灯或LED)和发射光检测器(如CCD或光电二极管)。
尽管生产商可在模块的各孔内实现极佳的激发光强度和发射光灵敏度一致性，但仍始终有些差异存在。
这种差异会随仪器年限和使用的增加而增加。
反应板内未校正的激发/发射光差异可引起Ct值改变。
但如果反应中存在参比荧光染料，则上述差异对报告基团和参比荧光信号的影响程度相同，因此报告基团的参比荧光标准化可校正其差异。
一般光学波动 在传统的塑料PCR反应板和管内，液体试剂处于孔底，空气在液体的上方，孔上采用了塑料密封。
该配置可出现多种与温度有关的现象。
在循环过程中，温度可达到95°
C。
在这么高的温度下，水可挥发至孔内的气体空间内。
该水蒸气或水流将在冷的管壁上冷凝，形成水滴后滴入底部的试剂中。
整个过程称为“回流”，在PCR过程中连续进行。
其次，在高温下，液体试剂内溶解的气体的溶解性下降，产生小气泡。
第
三，水流的压力将给塑料密封施加作用力，使PCR过程中密封形状出现轻微改变。
上述所有温度相关的现象都在激发和发射光的光径上，可引起荧光信号波动。
这些波动的程度各异，具体取决于多个因素，如试剂中溶解的空气量及反应板的密封程度。
一般波动通常不会使报告基团信号产生明显的失真，但它们可影响重复样本的精度。
如有波动存在，参比荧光染料与报告基团的光径相同，报告基团的参比荧光信号标准化可校正上述波动。
精度提升 参比荧光染料标准化的校正作用将提升实时荧光定量PCR数据的精度。
提升度各不相同，取决于各种因素，如试剂和反应板的制备方法。
异常光学波动 异常光学波动是所有运行反应中不普遍存在的热学相关的异常，可使报告基团信号产生明显失真。
异常光学波动的示例之一是反应板密封配置的重要变化，被称为“光学扭曲”。
当反应孔密封不当时可出现光学扭曲，随后，在PCR过程中，加热的盖子的热量和压力可使密封合适。
另一个示例是PCR过程中大气泡的破裂。
扩增曲线中的变形可能引起基线问题，甚至可影响Ct值。
参比荧光染料标准化提供了极佳的光学扭曲校正，可完全消除校正后的标准曲线中的异常。
标准化不能完全校正大气泡破裂，但有助于使数据失真最小化。
1 19 实验设计
2 实验设计 2.1引言 22 2.2实时荧光定量PCRAssay类型 22 2.3扩增片段和引物设计的考虑因素 23 2.4核酸纯化和定量 26 2.5逆转录的考虑因素2.6对照品 228 30 2.7标准化方法 30 2.8采用标准曲线评估效率、灵敏度和可重复性 32 21 实验设计 2.1引言 成功的实时荧光定量PCRAssay设计和开发是获取准确数据的基础。
前期规划将有助于管理在此过程中出现的实验差异。
在着手实验设计前，应清晰地了解Assay的目标，尤其是需要回答哪些生物学问题。
例如，旨在确定特定疾病状态下某个基因的相对表达水平的实验与旨在确定该疾病状态下病毒拷贝数的实验具有很大的差异。
在确定实验目标后，识别适当的实时荧光定量PCR对照和进行实验优化 的可能性。
本部分将介绍实时荧光定量PCRAssay设计和执行的各个阶段。
我们将从下面几个方面鉴别差异的来源、其在数据准确性方面的作用以及优化指导原则： •靶向扩增片段和引物设计•核酸纯化•逆转录•质控品和标准化•效率、灵敏度和可重复性标准曲线评估
2 2.2实时荧光定量PCRAssay类型 基因表达谱分析是实时荧光定量PCR的常见应用之
一，其通过评估转录本的相对丰度，确定不同样本的基因表达图谱。
RNA质量、逆转录效率、实时荧光定量PCR效率、定量方法及标准品基因的选择在基因表达实验中发挥了尤为重要的作用。
病毒滴度测定Assay的设计较为复杂。
研究人员通常想要定量样本中的病毒拷贝数。
一般采用已知基因组等效物或从已滴定的病毒对照品中采集的核酸生成标准曲线，通过与标准曲线进行比较实现滴度测定。
实验成功与否取决于生成标准曲线所用的材料的准确度。
根据靶点的性质——RNA或DNA病毒——逆转录和实时荧光定量PCR的效率亦具有重要的作用。
病毒是否为功能性病毒或该研究是否对总病毒颗粒进行分析，都将影响到Assay设计。
在拷贝数变异分析中，基因组进行重复或缺失分析。
Assay设计，特别是标准曲线的生成将取决于是要求相对还是绝对定量。
Assay设计主要关注区分单拷贝差异需要的实时荧光定量PCR效率和准确度。
最后，等位基因分型Assay可以检测低至单核苷酸水平的差异。
与上述方法不同，它需要检测终点荧光，确定SNP基因型。
引物和探针设计是确保等位基因特异的交叉反应性低发生率的关键。
22 实验设计 2.3扩增片段和引物设计的考虑因素 靶向扩增片段大小、GC含量、位置和特异性 反应效率对实时荧光定量PCR数据的准确度极为重要，本指南将在后面的部分对此进行更详细的介绍。
在理想状态下，每个循环后，PCR反应中的每个靶点拷贝将被复制，全长靶分子数目倍增：这对应100%扩增效率。
随着热循环过程的进行，效率的差异将被放大。
因此，100%效率的任何偏差均可导致潜在的错误数据。
使效率偏差最小化的一种方法是扩增相对较短的靶点。
在特定的循环中扩增100bp的区域相比扩增1,200bp的靶点，更有可能实现完整合成。
因此，实时荧光定量PCR靶点的长度一般为60–200bp。
此外，较短的扩增片段受靶点-模板完整性差异的影响更小。
如果核酸样本出现轻微降解，而靶序列较长，则上游和下游引物在同样的DNA片段中寻找其互补序列的难度将更大。
扩增片段的GC含量和二级结构是引起数据不准确的另一个因素。
如果二级结构阻碍了DNA聚合酶的路径，则每次循环更有可能出现不完美的靶点扩增。
理论上，设计的引物应可与中等(50%)GC含量且无明显GC延伸段的区域退火结合并扩增。
对于cDNA扩增，最好使扩增片段位于转录本的3’端附近。
如果RNA二级结构阻止了某些转录本的全长cDNA合成，则这些扩增片段受影响的可能性更小(图14)。
靶点特异性是影响数据准确度的另一个重要因素。
设计实时荧光定量PCR引物时，应检查引物以确保其结合位点是基因组中独一无二的。
这降低了引物扩增样本基因组中的其它类似序列的几率。
引物设计软件程序自动去除位于起始基因组和掩蔽同源区域的靶序列，避免了这些位点的引物设计。
基因组DNA、假基因和等位基因变异体 在检测基因表达水平时，需要关注RNA样本中的基因组DNA残留。
gDNA可与目的靶点转录本共扩增，从而产生无效数据。
通过设置不含有逆转录酶的对照反应(RT质控品)检测基因组DNA污染；如果RT质控品的Ct值高于稀释度最高的靶点生成的Ct值，则表示无gDNA信号生成。
但由于gDNA可竞争反应组分(如dNTP和引物)，因此会影响反应的效率。
实时荧光定量PCR中避免gDNA干扰的最佳方法是利用gDNA中存在而mRNA中不存在的内含子，进行周到的引物(或引物/探针)设计。
设计TaqMan®GeneExpressionAssay时应尽可能使TaqMan®探针覆盖相邻两个外显子交界处。
设计用于基于SYBR®Green染料检测的引物组时，应使引物与相邻外显子序列退火结合，或者使其中一个引物覆盖相邻两个外显子交界处。
当上游和下游PCR引物与同一个外显子退火结合时，则它们既可以扩增DNA靶点，也可以扩增RNA靶点。
相反，当引物与相邻外显子序列退火结合时，大多数情况下仅可以扩增cDNA，这是由于gDNA扩增片段包括内含子序列，从而导致扩增片段过长，无法在实时荧光定量PCR条件下实现高效扩增。
假基因或沉默基因是设计引物时也需要考虑的转录本变异体。
它们是现有基因的衍生物，由于启动子或基因本身的突变和/或重排导致了功能丧失。
引物设计软件程序可进行BLAST搜索，避免出现假基因及其mRNA产物。
等位基因变异体是一个基因的两种或多种独特的形式，它们具有相同的染色体位点。
源自上述变异体的转录本相差一个或多个突变。
设计引物时应考虑等位基因变异体，具 图14.具有高度二级结构的RNA分子。
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2 实验设计 体取决于研究的是一个还是多个变异体。
此外，变异体之间的GC含量差异可改变扩增效率，并在熔解曲线上生成单独的峰，易被错误地诊断为脱靶扩增。
设计引物时还应考虑可变剪接的变异体。
引物和探针的特异性、二聚体形成和自折叠 引物二聚体形成的最常见原因是正向和反向引物的相互作用，但也可能是由于正向引物与正向引物或反向引物与反向引物之间的退火或者单个引物自身的折叠引起的。
在更复杂的反应(如多重实时荧光定量PCR)中，引物二聚体更值得关注。
如果以交错排列的方式形成二聚体(通常是这种情况)，则可出现一定的延伸，形成大小接近目的扩增片段的产物，且丰度随着循环的进行而增高。
一般而言，PCR反应的起始靶点量越少，形成引物二聚体的可能性越大。
上述潜在问题的积极方面在于，引物二聚体之间的相互作用弱于目的引物与模板之间的相互作用，此外，有很多方法可以最大程度地减少或消除此现象。
引物二聚体的主要问题在于它们可引起假阳性结果，特别是使用DNA结合染料(如SYBR®GreenI染料)的反应。
另一个问题是它会导致与反应组分的竞争作用，使反应效率超出90-110%的理想范围。
最后一个主要问题也与效率有关，是反应的动态范围可能缩小，从而影响反应的灵敏度。
即便信号并非来自引物二聚体本身(如TaqMan®Assay)，反应的效率和动态范围仍将受到影响。
有几款免费的软件程序可分析您的实时荧光定量PCR引物设计，并确定它们是否容易形成二聚体或自折叠。
AutoDimer程序(由美国国家标准与技术研究院的
P.M.Vallone编制)是一款可同时分析各种引物的生物信息学工具(图15)。
这尤其适用于多重反应领域。
但虽然引物序列的生物信息学分析会大大降低二聚体形成的风险，但仍需要通过实验对二聚体形成进行监测。
传统的引物二聚体筛查方法是凝胶电泳，二聚体会在凝胶的底部形成扩散的模糊条带(图16)。
凝胶验证的问题之一是它的灵敏度不高，因此可能无法得出结果。
但凝胶分析 图15.AutoDimer软件屏幕截图。
该软件可用于分析引物序列并报告引物内可能的二级结构区域(可导致引物自折叠)或可使引物相互退火结合的延伸段序列。
图16.通过琼脂糖凝胶分析研究引物二聚体的形成。
在热循环反应前，将核酸样本连续梯度稀释后加入PCR混合物中，然后从每种混合物中取相同体积上样，进行琼脂糖凝胶电泳。
引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带。
适用于验证从熔解/解离曲线获取的数据，这是检测引物二聚体的最佳方法。
采用DNA结合染料进行检测的实时荧光定量PCR运行结束后，应生成熔解或解离曲线。
简言之，仪器从低温状态开始升温，低温下DNA呈双链且荧光强度较高，达到高 24 实验设计 温时，DNA开始变性，荧光强度开始下降。
在PCR过程中生成的各产物的Tm值处将观察到荧光出现明显下降。
比较无模板对照(NTC)的熔解曲线峰与靶点峰，确定反应中是否存在引物二聚体。
理论上，包含模板的每个反应应观察到一个单峰，而NTC中应无荧光峰存在。
在较低熔解温度下出现的比目的扩增片段更小、更宽的峰，且同时出现在NTC反应中的，通常是二聚体。
同样，产物凝胶电泳常可用于验证熔解峰对应的产物的大小。
有些情况下，引物二聚体存在并不会影响实时荧光定量PCR分析的总体准确度。
一个常见的现象是引物二聚体存在于无模板对照中，但在包含模板DNA的反应中没有。
这并不奇怪，因为在模板不存在时，引物更有可能相互作用。
当有模板存在时，不利于引物二聚体形成。
只要在NTC中观察到的峰未出现在模板解离曲线上，引物二聚体就没有问题。
引物二聚体是一大类非特异性PCR产物中的一部分，包括当引物与不理想位点不完美匹配后退火结合形成的扩增片段。
非特异性产物扩增值得关注是因为它们可发出荧光，人为地改变反应的Ct值。
它们可以通过竞争反应组分影响反应效率，降低动态范围和数据准确度。
在绝对定量分析中，需要报告精确的拷贝数，因此非特异性产物更值得关注。
标准凝胶电泳通常是实时荧光定量PCR特异性分析的第一步。
它可以鉴别与您的靶点扩增片段大小不同的产物，但其条带会掩盖大小相似的扩增片段，且灵敏度有限。
鉴 于熔解曲线分析的准确度和灵敏度，它是确认凝胶电泳引物特异性评估的最值得信赖的方法。
尽管非特异性扩增应始终尽量避免，但在某些情况下，这些二级产物的存在并不会引起严重的问题。
例如，如果以GC含量不同的异构体或多个等位基因为靶点，则预计会出现多个产物。
引物设计的考虑因素 设计实时荧光定量PCR引物时有下列推荐：PrimerExpress®，OligoPerfect™Designer和VectorNTI®软件。
请注意，引物设计软件程序，如我们的在线OligoPerfect™设计程序和VectorNTI®软件序列分析软件，可与我们的在线订购系统无缝连接，因此您无需复制粘贴序列。
这些程序可自动设计针对特定基因或靶序列的引物，其算法采用了下列指导原则，此外还可以进行已知序列同源物的全基因组BLAST搜索。
•设计引物的长度一般为18–28个核苷酸•避免重复核苷酸延伸段•目标为50%GC含量，有助于防止错配稳定化•选择Tm值匹配的引物(在5°C范围内)•避免一个分析中采用的所有引物之间以及各引物内部 出现序列互补
2 25
2 实验设计 2.4核酸纯化和定量 实时荧光定量PCR核酸纯化方法 在进行核酸纯化之前，必须考虑原材料(细胞或组织)及可能的技术限制。
DNA和RNA提取技术在易用性、是否需要有机溶剂及因残余DNA(在RNA提取中)、蛋白质和有机溶剂导致的核酸纯度方面差异较大。
本部分将重点讨论RNA提取，但其中大部分指导原则亦适用于DNA提取。
一步法有机试剂萃取是一种极为有效的从各种细胞和组织类型中纯化RNA的方法。
许多实验方案采用酚和异硫氰酸胍混合物破坏细胞，溶解细胞组分，同时保护核酸不被RNA酶降解，维持核酸的完整性。
异硫氰酸胍是一种高离液盐，可防止RNA被内源性的RNA酶降解(Biochemistry18:5294(1979))。
一般随后加入氯仿，通过离心将混合物分为水相和有机相。
在异硫氰酸胍存在的情况下，RNA只保留在水相中，而DNA和蛋白质存在于有机相和相界面中。
然后采用异丙醇沉淀，从水相中提取出RNA。
此过程相对较快，可以获得高水平的RNA，但需要使用有毒的化学试剂，且DNA残留量较采用其它技术更高。
残留的胍、酚或乙醇还会大大降低cDNA合成的效率。
大多数基于硅胶磁珠或过滤器的方法是在存在异硫氰酸胍的溶液中裂解样本并匀浆化。
匀浆化后，在样本中加入乙醇，RNA与硅胶磁珠或过滤器结合，通过冲洗有效去除杂质，ProcNatlAcadSciUSA76:615(1979)。
用水洗脱纯化的总RNA。
与有机萃取法相比，该方法更省时，且无需使用酚。
RNA产量不高，但纯度(蛋白质、多糖、DNA和纯化试剂)更好。
仍会出现因冲洗不充分导致的胍和乙醇残留，且同样会对cDNA合成的效率产生负面影响。
最后，将有机裂解与硅胶柱相结合的方法可提供良好的样本裂解，以及硅胶结合法所具有的简便、速度和纯度优势。
评估RNA的品质 在评估RNA品质和数量时，应注意几个关键点。
确保A260/A280比值在1.8和2.0之间。
比值低于1.8表示存在蛋白质污染，会降低反应效率。
A260/A280比值有助于评估包含苯环的组分的残留，如离液盐异硫氰酸胍和酚，它们会抑制酶反应。
在变性凝胶或诸如AgilentBioanalyzer等仪器上评估RNA的完整性(图17)。
图17.AgilentBioanalyzer示踪和凝胶成像显示RNA的完整性。
完整的哺乳动物总RNA显示了两个条带或峰，分别代表18S和28SrRNA。
一般而言，28SrRNA的亮度(或Bioanalyzer示踪中峰的面积)是18SrRNA的两倍。
AgilentBioanalyzer®系统只需一步即可测定RNA品质，并分配RIN(RNA完整值)值。
利用全部示踪(包括降解产物)计算RIN值，其效果优于仅评估rRNA峰。
研究人员随后可以比较不同组织类型RNA的RIN值，评估质量标准化和一致性维护。
26 实验设计 定量准确度 在RNA定量领域，荧光染料(如RiboGreen®和PicoGreen®染料)具有更高的灵敏度、准确度和高通量性能，效果优于紫外吸光度测量法。
紫外吸光度测量无法区分核酸和游离核苷酸。
事实上，游离核苷酸在260nm的吸光度高于核酸。
紫外吸光度测量同样无法区分同一样本中的RNA和DNA。
此外，纯化核酸样本中常见的污染物会影响紫外吸光度读数。
最后，大多数紫外吸收光酶标仪在测量过程中需要消耗大量的样本。
可供选择的荧光染料种类很多，我们可以找出能克服上述所有限制的试剂：能够区分核酸和游离核苷酸的染料，能够区分同一样本中的RNA和DNA的染料，以及对常见样本污染物不敏感的染料。
Qubit®定量平台利用Quant-iT™荧光技术，采用先进的荧光基团，一旦与DNA、RNA或蛋白质结合即可发出荧光。
该特异性意味着您可以获得比紫外吸光读数更准确的结果，因为Quant-iT™分析试剂盒只报告靶分子的浓度(而非污染物)。
一般而言，采用荧光染料的定量方法极为灵敏且只需少量样本。
表达研究中的基因组DNA残留 我们在前面介绍了引物设计是避免实时荧光定量RT-PCR反应中的DNA扩增的第一步。
在RNA提取阶段采用DNA酶处理样本，可从源头控制DNA。
除传统的DNA酶I外，LifeTechnologies还可提供超高活性的TURBO™DNA酶，其催化活性优于野生型DNA酶
I。
它甚至可以去除少量的DNA，避免其影响RT-PCR。
DNA酶处理可以在溶液或分离柱内完成，具体取决于分离方法。
柱上DNA酶处理常用于硅胶基质萃取，与溶液内处理不同，它在EDTA存在的条件下无需热灭活，因为盐本身可以去除酶。
其缺点在于柱上反应需要更多的酶。
溶液内DNA酶反应通常需要在65°C下对DNA酶进行热灭活。
反应所需的游离镁在此温度下可引起镁依赖的RNA水解。
DNA-free™和TURBODNA-free™试剂盒采用了新型DNA酶灭活试剂，有助于避免上述问题。
灭活试剂不仅可以去除反应中的DNA酶，还可以结合并去除反应缓冲液中的二价阳离子。
这还减少了将二价阳离子引入RT-PCR反应的问题，二价阳离子会影响反应的效率。
2 27
2 实验设计 2.5逆转录的考虑因素 逆转录酶 qRT-PCR中使用的大多数逆转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)。
天然AMV逆转录酶的热稳定性一般优于M-MLV，但产量较低。
但是，对这些天然的酶进行适当的处理，可生成适用于qRT-PCR的变异体。
理想的逆转录酶具有下列特性： •热稳定性——如前所述，二级结构对反应灵敏度的影响较大。
天然RT在理想工作温度为42°C至50°
C，而热稳定性RT在该温度范围的上限(或者更高)方可发挥作用，实现GC富集区域的逆转录 •降低的RNA酶H活性——常见的天然逆转录酶中存在RNA酶H结构域，它在体内可剪切RNA-DNA杂交双链的RNA链，供复制的下一阶段使用。
在qRT-PCR应用领域，RNA酶H活性可大幅降低全长cDNA的产量和比例，从而降低了反应的灵敏度。
现推出的几种RT(尤其是SuperScript®II和III)具有较低的RNA酶H活性。
一步法和两步法qRT-PCR 可从便捷性、灵敏度和Assay设计几个方面选择一步法和两步法qRT-PCR。
必须根据各个实验评估各种技术的优点和缺点。
在一步法反应中，逆转录过程中同时存在逆转录酶和热稳定性DNA聚合酶，RT在高温DNA聚合酶活化阶段被灭活(所谓的热启动)。
正常情况下，适合RT的缓冲液不适用于DNA聚合酶。
因此，一步法缓冲液是一种折中的溶液，为两种酶提供了可以接受但并非最佳的功能。
虽然其功能性稍差，但采用这种单管操作，在PCR阶段可以对生成的所有cDNA进行扩增。
一步法qRT-PCR的优点包括： •防止污染——闭管系统可防止在RT和PCR阶段引入污染物 •便捷——移液步骤减少，最大程度缩短操作时间•高通量样本筛选——理由如上•灵敏度——由于生成的所有第一链cDNA均被用于实 时荧光定量PCR扩增，因此一步法反应的灵敏度高于两步法反应 一步法qRT-PCR的缺点包括： •形成引物二聚体的风险更高——一步法反应中存在的正向和反向基因特异性引物，极易在42–50°C逆转录条件下形成二聚体。
对于采用DNA结合染料进行检测的反应，这个问题尤为严重 •cDNA不适用于其它实时荧光定量PCR反应——一步法反应采用了RT步骤的所有cDNA，因此如果反应失败，则样本丢失 在两步法qRT-PCR中，逆转录的缓冲液已针对逆转录酶进行优化。
逆转录完成后，约10%的cDNA被转移至各个实时荧光定量PCR反应中，且采用了最佳的缓冲液。
两步法qRT-PCR的优点包括： •cDNA可以保存并用于其它实时荧光定量PCR反应——两步法qRT-PCR生成了足量的cDNA，可用于多个实时荧光定量PCR反应，适用于珍贵或有限的样本 •灵敏度——由于两步法反应的RT和实时荧光定量PCR反应分别采用了优化的缓冲液，因此其灵敏度优于一步法 •多靶点——根据使用的RT引物，您可以从单个RNA样本中筛查多个靶点 两步法qRT-PCR的缺点包括： •RT酶和缓冲液可抑制实时荧光定量PCR——由于RT及相关的缓冲液如果稀释不当，可抑制DNA聚合酶，因此一般仅10%的cDNA合成反应被用于实时荧光定量PCR。
特定的抑制水平取决于RT、靶点的相对丰度和扩增反应的可靠性。
•便捷性较差——两步法反应需要更多操作，不适用于高通量应用 •污染风险——由于每步使用单独的试管，因此增加了污染的风险 28 实验设计 RNA引物设计策略 逆转录是qRT-PCR反应中最可变的部分。
第一链合成反应可使用基因型、oligo(dT)或随机引物(图18)，引物选择对于RT效率和一致性的影响较大，进而影响数据的准确度。
随机引物可用于生成大量的cDNA，因此可提供最高的实时荧光定量PCR灵敏度。
它们还适用于非多聚腺苷酸化RNA，如细菌RNA。
由于它们可与整个靶分子退火结合，因此降解的转录本和二级结构不会引起与基因特异性引物和oligo(dT)引物同样严重的问题。
尽管产量提高是随机引物的一个优点，但数据显示它会高估拷贝数。
采用随机和oligo(dT)引物的结合物可结合它们在RT反应中的优点，提高数据质量。
随机引物仅适用于两步法qRT-PCR反应。
Oligo(dT)引物具有mRNA特异性，且当其用于引物反应时，可对同一cDNA库的许多不同靶点进行分析，因此是两步法反应的理想选择。
但是，由于它们始终从转录本的3’端开始逆转录，复杂的二级结构可导致不完整cDNA的生成。
片段化RNA的oligo(dT)引发，如从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本中分离的RNA也有问题。
不过，只要实时荧光定量PCR引物的设计靠近靶点的3’端，在此位点下游提前终止将不会引起严重的问题。
有多种类型的oligo(dT)可供选择。
Oligo(dT)20是20-mer胸苷的均匀混合物，oligo(dT)12-18是12-mer至18-mer胸苷的混合物。
锚定oligo(dT)引物在3’UTR/poly(A)交界处退火结合，可避免poly(A)滑移。
最佳oligo(dT)的选择在一定程度上取决于反应温度。
热稳定性更高的RT采用较长引物的反应效果更佳，与较短的引物相比，它们在高温下可维持更紧密的退火结合。
如果18SrRNA用于标准化，则不推荐oligo(dT)引物。
序列特异性引物可提供最高的特异性，是最稳定的RT引物方案。
但它们不具备oligo(dT)和随机引物的灵活性，仅能生成1个cDNA拷贝的靶基因产物。
正因如此，基因特异性引物一般不是稀有或珍贵样本研究的最佳选择。
一步法qRT-PCR反应均采用基因特异性引物进行第一链合成，其它引物方案适用于两步法反应。
每种引物类型理论上都具有独特的优点和缺点。
此外，单个靶点对不同引物的反应各异。
理论上，应在初始Assay验证阶段对各种引物选项进行评估，以确定哪种引物可提供最佳的灵敏度和准确度。
影响逆转录效率的因素 qRT-PCR反应的RT阶段的稳定性低于PCR阶段。
这是与起始样本有关的多种因素造成的，一般未经过热稳定性DNA聚合酶测试。
这些因素包括： RNA完整性差异：特定RNA样本的降解程度直接影响了转换为cDNA后定量的mRNA靶点的百分比。
根据使用的第一链引物的不同，降解阻止了RT形成可与全长靶点扩增片段反应的cDNA。
RT效率越低，PCR分析的灵敏度越低。
未经过标准化的效率差异可导致不准确的结论。
2 图18.常用的RNA引发策略图示。
29
2 实验设计 GC含量、RNA样本复杂性和采用的RT酶：如果RT对样本之间不可避免的差异的敏感度较低，则RNA表达水平比较更准确。
例如，数据显示所有背景核酸与RT引物不相容，可使反应效率产生高达10倍的差异。
最好使用能在此背景下实现稳定的cDNA合成的RT。
有机溶剂和离液盐残留：乙醇和胍是RNA捕获所必需的，但会抑制酶反应。
RNA样本间上述污染物的含量差异可影响样本的比较。
因此，使用上述副产物含量相对较低的RNA提取方法至关重要。
我们还建议在实时荧光定量PCR反应中使用验证的标准品基因。
2.6对照品 实时荧光定量PCR反应的对照品可证明从实验样本中获取的信号可表示目的扩增片段，从而验证了反应的特异性。
所有实验应包括无模板对照(NTC)，qRT-PCR反应还应包括无逆转录酶(no-RT对照)。
NTC对照品应包含除DNA或cDNA样本外的所有反应组分。
这些孔内检测到的扩增是由于引物二聚体或PCR反 应产物的污染。
这种污染类型可使测得的表达水平高于实际值。
No-RT反应应包含除逆转录酶外的所有反应组分。
如果在no-RT对照品反应中可观察到扩增产物，则表示DNA而非cDNA被扩增。
这也可以人为夸大实验样本的表达水平。
2.7标准化方法 在本指南的开头，我们指出消除实验不一致性对于实时荧光定量PCR实验设计极为重要。
偏离实验计划会限制研究人员比较数据的能力，如果在分析时未考虑此偏离，则可导致错误的结论。
实验差异的来源包括起始样本的性质和数量、RNA提取过程、逆转录以及实时荧光定量PCR扩增。
标准化是中和上述差异效应的重要过程。
在实时荧光定量PCR的每个阶段都有单独的标准化策略，但其中一些策略更为有效。
这包括： 样本量标准化：利用相同量的样本(如组织或细胞)进行RNA或DNA提取可使差异最小化，但这只是近似值，且无法解决RNA提取中的偏差。
RNA或DNA量标准化：必须对RNA或DNA样本进行精确的定量和质量评估，但只采用该方法进行标准化仍存在不足，因为其无法控制逆转录和实时荧光定量PCR的效 率差异。
例如，污染物水平的微小差异会影响RT反应并降低扩增效率。
在PCR过程中样本的差异会被扩增，可能出现与样本的生物状况无关的巨大倍数变化。
移液也容易出现操作差异，且无法利用纯化后RNA分析的标准化来补偿。
参考基因标准化：使用标准品基因(又称为参考基因或内源性对照)是解决实时荧光定量PCR中几乎所有来源的差异最彻底的方法。
但采用此方法时，所有样本中的该基因必须表达一致。
有效的标准品基因可对照RNA的质量和数量，以及逆转录和实时荧光定量PCR扩增效率的差异。
如果两个不同的样本中逆转录或者DNA聚合酶扩增靶点的效率不同，则标准品转录本将反映出该差异。
可使用内源性参考基因，如看家基因或外源性核酸靶点。
30 实验设计 内源性对照 实时荧光定量PCR中的常见内源性标准品包括： •β-actin(ACTB)：细胞骨架基因•18S核糖体RNA(rRNA)：核糖体亚单位•亲环素A(PPIA)：丝氨酸苏氨酸磷酸酶抑制剂•3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：糖酵解途径•β-2-微球蛋白(B2M)：主要组织相容性复合体•β-葡萄糖苷酸酶(GUSB)：溶酶体内的外切糖苷酶•次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)：嘌呤补救合成 途径•TATA框结合蛋白(TBP)：RNA转录 由于每个实时荧光定量PCR实验各不相同，仔细周详的计划应包括选择标准品。
标准品的选择不是根据实验室中其他人的使用情况，而是应选择最符合特定靶点的定量策略的标准品。
质量标准品的第一个要求是其丰度与您的靶基因产物相当。
这对于多重反应尤为重要，因为如果在达到靶点Ct之前先达到标准品反应平台，标准品将阻碍靶点扩增，导致靶点Ct升高，从而影响反应的进行。
标准品反应还可采用引物限制条件，模拟较低的表达水平。
大多数TaqMan®内源性对照Assay可提供引物限制配方。
标准品靶点的实时荧光定量PCR分析的扩增效率应与实验靶点分析相当；可采用标准曲线进行评估。
尽管在比较不同效率的反应时可采用校正因子，但当反应效率相当时，准确度更高。
最后也是最重要的一点，无论样本的治疗或疾病状态如何，标准品的表达应保持稳定。
这必须通过实验测定，如图19所示。
应进行多次重复确保准确度，但无疑亲环素(PPIA)、TBP和HPRT1并不适用于这些治疗组，因其经过治疗后可出现表达下调。
即便是最常用的参考基因，在特定的条件下其表达水平亦有可能改变，因此应始终对其进行验证： 图19.常用内源性对照的基因表达水平及标准化的重要性。
在本例中，分析两个治疗组和一个正常组的常用参考基因表达水平，一同扩增的还有内部阳性对照(IPC)。
IPC提供了正常反应间差异的标准。
条形代表各治疗组与正常样本相比，标准品的上调和下调，正常样本的ΔCt为
0。
其目标是找到一种模拟IPC变化的标准品。
•GAPDH是一种常用的标准品，其在多数情况下表达稳定。
但是，GAPDH在某些癌症细胞、采用抑癌基因处理的细胞、缺氧状态及锰或胰岛素处理的样本中表达上调。
•β-actin是另一种常用的看家基因，其在大多数细胞类型中适中表达。
但其在乳腺上皮细胞、囊胚細胞、猪组织和牛心肌等中的表达稳定性尚有疑问。
•18SrRNA占细胞总RNA的85–90%，且其在大鼠肝脏、人皮肤成纤维细胞及人和小鼠恶性细胞组织中表达稳定。
但其丰度水平不适用于中等和低表达的靶点。
寻找适当的RNA浓度，使18SrRNA提供足够宽的基线，且在40个循环内生成目的靶点Ct，这通常较为困难。
此外，多重反应必须限制18S引物的浓度，以防标准品将所有反应组分隔离，使PCR条件不利于目的靶点的扩增。
2 31
2 实验设计 其它方法不取决于单个参考基因的准确度，而是多个验证标准品的几何平均数。
使用多个一致的标准品可更好地缓冲单个基因的Ct波动，从而提高分析和样本类型的灵活性。
外源性标准品 外源性标准品并不常用，但如果无法找到针对特定样本组的高度一致的内源性标准品，则外源性标准品是一种可行的选择。
外源性参考基因是合成或体外转录的RNA，其序列在实验样本中并不存在。
鉴于其外源性，它不会在不同状态或治疗的细胞中出现正常的生物学波动。
当使用外源性标准品时，其加入实验流程越早，则可以对照的步骤越多。
例如，如果将外源性转录本加入细胞裂解缓冲液中，则它可用作细胞裂解、RNA纯化及后续RT和PCR反应的标准品。
例如，外源性标准品有植物特异性的体外转录RNA，如光合作用基因。
由于哺乳动物没有同样的内源性转录本，因此可将它插入哺乳动物样本内。
采用外源性标准品的缺点有： •它不是内源性的。
在工作流程的早期插入外源性标准品(例如加入细胞裂解缓冲液中)，可使其用途最大化。
•当引入标准品时，准确度会受到加样差异的影响。
•长期储存和多次冻融可影响转录稳定性。
因此，应定 期进行拷贝数评估，确保其不会随时间变化而改变。
2.8采用标准曲线评估效率、灵敏度和可重复性 实验设计的最后一个阶段是验证前述参数可实现高效、灵敏且可重复的实验。
反应效率 如前所述，实时荧光定量PCR反应的整体效率取决于RT反应和PCR扩增反应的效率。
RT的效率取决于转换为cDNA的靶RNA百分比。
低转换率可影响灵敏度，但样本间转换百分比差异的影响更大。
PCR扩增效率是实时荧光定量PCR反应中最稳定的因素。
但是，该扩增可指数放大RT效率的轻微差异，可能会导致错误数据的出现。
100%效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增，但可接受的分析验证范围为90-110%。
该效率范围对应的标准曲线斜率为-3.6至-3.1。
图20的图表显示了仅由反应效率差异导致的测量偏差。
验证所有待比较的靶点(如参考基因和目的基因)的反应效率，优化其效率使之尽可能一致，并在数据分析过程中采用效率校正可减少上述效应。
这些测量将在后面的数据分析部分进一步讨论。
反应效率的最佳评估方法是生成标准曲线。
通过构建连续稀释的样本核酸，并进行实时荧光定量PCR，生成标准曲线。
然后以起始核酸量为X轴，以Ct为Y轴，绘制结果曲线。
用于生成标准曲线的样本(尽可能接近)应与将用于实验的样本匹配(即相同的总RNA或DNA样本)。
标准曲线分析的稀释范围或动态范围应涵盖实验样本预期的浓度范围。
曲线的斜率可用于测定反应效率，大多数科学家认为反应效率应在90%至110%之间。
32 实验设计 图20.不同的扩增效率引起的偏差效应。
四种不同的实时荧光定量PCR反应的效率在70%至100%之间。
其差异在早期循环并不明显。
但在30个循环之后，效率为70%的反应与效率为100%的反应之间报告的拷贝数差异达100倍。
反应的循环数越多，分析要求的灵敏度越高，效率差异就显得越重要。
图21.利用标准曲线评估实时荧光定量PCR反应的示例。
2 在图21中，生成了三种不同靶点的标准曲线。
红色和蓝色曲线平行表示它们的效率相当，因此可在任意稀释度实现准确比较。
此类型的比较示例是将标准品基因与靶基因进行比较，调整样本间的非生物学差异。
但紫色曲线在较低浓度下的效率也较低，因此无法在低浓度下实现准确比较。
除评估实验状态并为相对定量提供效率值外，标准曲线还可用于确定特定的反应问题是由于抑制还是缺少优化造成的。
在手册的疑难解析部分将对此问题进行更详细的讨论。
灵敏度和可重复性 效率在90–110%的理想窗口内的标准曲线确定了实时荧光定量PCR反应可测量的起始模板量范围。
某种程度上可通过靶点Ct在扩增曲线上出现的时间测定灵敏度。
但是，分析灵敏度的实际测量方法是特定少量的模板是否适用于标准曲线并维持理想的扩增效率。
符合要求的稀释度最高的样本决定了反应灵敏度。
标准曲线还包括R2值，用于测量重复样本的可重复性。
重复标准曲线以评估一致性，从而保持样本的数据准确度。
33 反应板制备
3 3.1混合3.2反应板装载3.3反应板密封3.4反应板插入 反应板制备 36363637
3 35 反应板制备 3.1混合 最好在短暂混合、离心所有实时荧光定量PCR反应组分后配制反应。
轻轻晃动含酶的预混液，短暂(1–2秒)涡旋其它组分(如PCR引物对或TaqMan®Assay)，解冻核酸样本。
由于实时荧光定量PCR预混液的密度高于其它实时荧光定量PCR反应组分，因此充分混匀反应混合物至关重要，否则将影响反应精度。
将试管轻轻上下颠倒几次，或者稍微涡旋1–2秒是高效的混匀方法。
但应避免过度涡旋，因其可形成气泡，影响荧光检测，并降低酶的活性，从而降低扩增效率。
应始终进行短暂离心，收集容器底部的内容物，并去除溶液的气泡。
3.2反应板装载 根据实验的性质确定试剂加入反应板或管的次序。
例如，如果您分析20种不同RNA样本中的5个基因的表达，则最好先将Assay混合物分至反应板或管内，然后加入样本。
另一方面，如果您只分析5种不同RNA样本中的20个基因的表达，则更简单的做法是先分配RNA样本，然 后加入Assay预混液。
无论加入试剂的次序如何，都应对移液进行规划，以免样本和Assay之间的交叉污染。
由于核酸具有亲水性且可迅速溶于Assay预混液，因此无需充分混匀反应组分。
3 3.3反应板密封 塑料PCR反应板可采用光学盖或光学覆膜密封，它们是一侧有粘性的薄塑料纸。
白色衬垫可保护其粘性。
覆膜的末端为带有穿孔的矩形凸起。
使用这些凸起操作覆膜，避免与其接触。
撕下白色衬垫，将覆膜置于反应板上方，边缘向内折起。
覆膜附带一个正方形的塑料安装工具。
用它弄平覆膜，特别是反应板上方的4个边缘。
还可在撕下白色条带时利用安装工具的边缘按住覆膜的各端，防止拉起覆膜。
检查反应板的上方，确认覆膜与反应板接触良好，特别是4个边缘。
密封好反应板后，拿起检查底部，看是否存在异常，如意外的空孔、液滴粘在孔壁上以及孔底存在气泡。
请注意空孔或体积异常的孔。
短暂离心反应板，解决粘附的液体和底部气泡问题。
应标记反应板裙边，或者提供条形码。
切勿写在反应板表面、孔的上方，这会影响荧光激发和读数。
也不要写在反应板底部，因为墨水会附在实时荧光定量PCR仪的模块上。
模块被彩色或荧光物质严重污染会影响实时荧光定量PCR数据。
36 反应板制备 3.4反应板插入 反应板准备好后，需遵循生产商的说明将其装载至实时荧光定量PCR仪中。
含有DNA或cDNA模板和AmpliTaqGold®试剂的反应板在室温下极其稳定。
它们可在正常的实验室光线条件下室温储存。
避免装载的反应板受到阳光直射；这会对混合物中的荧光染料造成影响。
如果您需要将反应板运送至室外，可用铝箔包裹反应板，以免阳光直射。
对于带有可更换的热循环模块的仪器，应确保安装与反应板类型相匹配的模块。
请注意96孔标准模块和96孔快 速模板不一样。
标准96孔反应板和标准管的容量为0.2mL，而快速96孔反应板和快速反应管的容量仅为0.1mL。
即便未使用快速模式，快速塑料产品也必须采用快速模块。
装载过程因仪器型号而异。
一些仪器带有抽屉式系统：拉出抽屉，将反应板置于模块或固定装置上，然后推回抽屉。
在某些仪器中，反应板位于仪器臂上，由计算机控制。
3 37 数据分析
4 4.1引言4.2绝对定量4.3相对定量4.4高分辨率熔解曲线(HRM)分析4.5多重实时荧光定量PCR分析 数据分析 4040424446
4 39 数据分析 4.1引言 如实验设计的开始部分所述，定量方法的选择取决于实验的目标。
•绝对定量可测定靶点的实际拷贝数，但也是最费力、最复杂的定量形式。
此方法要求周密的计划和高度准确的标准曲线。
绝对定量常用于确定病毒滴度。
•相对定量也需要仔细规划，但生成的数据是相对丰度，而非确切的拷贝数。
这是适用于基因表达研究的方法，可提供两种主要的定量方案：ΔΔCt和标准曲线定量。
4 4.2绝对定量 绝对定量是适合需要测定靶点实际拷贝数的研究人员采用的实时荧光定量PCR分析方法。
要进行绝对定量，需对已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧光定量PCR扩增，利用获得的数据生成标准曲线，标准曲线以各靶点浓度及相应的Ct值绘制。
然后将未知样本的Ct值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。
标准曲线生成——概述 采用绝对标准曲线，目的靶点的拷贝数必须已知。
这表示在生成曲线前，应准确定量模板。
图22重点显示了标准曲线设置。
目的靶点样本被准确测定为含有2x1011个拷贝。
将样本连续八次稀释10倍至2x103个拷贝，对每个稀释样本进行实时荧光定量PCR，重复至少三次。
生成的标准曲线与每个特定的Ct的拷贝数相关。
然后通过与该标准曲线进行比较，推算出未知样本的拷贝数。
定量的准确度与标准曲线的质量直接相关。
在绝对定量时，应考虑： 图22.绝对定量标准曲线设置流程。
1.用于生成标准曲线的模板及定量该模板采用的方法是实验的基础。
连续稀释时的加样准确度极为重要。
还应记住实时荧光定量PCR的灵敏度会放大微小的人为误差。
2.目标模板和连续稀释的实际样本的RT和PCR效率相当至关重要。
标准曲线生成——模板选择 如前所述，生成绝对标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。
尽管您可能需要均匀的纯模板进行初始拷贝数测定和标准曲线生成，但最好使用与实验样本尽可能类似的目标模板。
由于诸如核酸提取和逆转录等步骤可影响反应的动态范围，所以应采用与实验样本尽可能相同的处理步骤。
下列类型的模板可用作绝对定量标准品：
1.DNA标准品：目的靶点的PCR扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆。
优点：易于生成、定量，可在适当的储存条件下维持稳定性。
缺点：无法进行qRT-PCR的逆转录步骤，大大影响了反应效率。
2.RNA标准品：目的靶点的体外转录RNA(图23)。
优点：结合了RT效率，最大程度地模拟了目的靶点。
缺点：需要耗费时间生成该标准品，因其不稳定，难以保持长期准确度。
RNA和DNA标准品的均质性意味着它们通常具有较实验样本更高的效率。
因此可将背景RNA(如酵母tRNA)插入标准模板中，形成更具异质性的环境，有助于平衡反应效率。
背景RNA可抑制cDNA合成率达10倍。
40 数据分析 图23.体外转录实验方案示意图。
利用实时荧光定量PCR生成的PCR产物可利用包含5’T7启动子的序列和包含3’poly(T)的逆转录引物重新扩增。
体外转录反应生成多聚腺苷酸化正义mRNA。
纯化后可将其准确定量并稀释，用于生成标准曲线。
图24.用于标准曲线生成的反应板设置。
计算平均阈值循环(Ct)值时，应除去重复反应中的最高值和最低值。
标准曲线应用——cRNA 为说明应如何遵循绝对定量标准曲线的建议，本部分将逐步介绍此定量方法中cRNA标准曲线的构建。
T7RNA聚合酶可利用质粒或PCR产物，用于生成均质的目的转录本。
由于其检测限较广且准确性更佳，因此建议采用互补RNA(cRNA)荧光检测，而不是紫外吸光度测量。
另一种精确的定量方法是数字PCR。
测定拷贝数后，以cRNA比tRNA1:100的比例加入不相关的酵母tRNA，模拟生物样本的正常背景。
然后将该标准品稀释至少5至6个数量级，用于实时荧光定量PCR中的Ct测定。
加样不准确对绝对定量数据影响较大。
适当的预防措施可尽量减小这种影响。
如图24反应板设置所示，制备三个单独的cRNA稀释梯度，每个梯度的每个稀释样本重复扩增两次。
必须记住，稀释梯度应涵盖实验样本可能出现的所有模板量。
例如，如果未知检测样本可能只含有10个拷贝，则标准曲线中的最低点不应包含100个模板拷贝。
每个稀释度获取六个Ct值。
除去最高和最低Ct值，计算剩余四个Ct值的平均值。
如果我们关注此样本中的10-4稀释度(图24)，我们可以观察到特定样本的Ct值在2个循环中是如何变化的。
通过指定稀释度(对应特定拷贝数)为21.4——平均Ct值，可使上述差异最小化。
4 41
4 数据分析 4.3相对定量 相对定量尽管仍存在技术挑战，但不像绝对定量那样严峻。
该技术适用于大多数基因表达研究，可分析校准(正常)样本和一个或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。
采用该技术无需精确测定拷贝数，而是关注与校准样本相比的倍数变化。
我们在此列出了相对定量的常用方法，以及各自是如何控制差异的。
相对定量算法——ΔCt 这是最基本的相对定量形式。
获取检测和校准样本的目的基因表达的Ct值，两者之间的差异为ΔCt。
倍数差异为2的ΔCt次幂。
倍数差异=2ΔCt 该方法不控制样本数量、样本质量或反应效率的差异，还存在不足(图25)。
相对定量算法——ΔΔCt ΔΔCt方法是一种非常普遍的技术，它比较了包括校准品(如未处理或野生型样本)和标准品(如看家基因表达)在内的实验样本的结果。
采用该方法，可根据检测样本和校准样本中的标准品(正常)基因的Ct调整同样两个样本中的目的基因(GOI)的Ct。
其得出的ΔΔCt值可用于测定表达的倍数差异。
倍数差异=2-ΔΔCt ΔCt样本-ΔCt校准品=ΔΔCt CtGOIs-Ct正常s=ΔCt样本 CtGOIc-Ct正常c=ΔCt校准品 ΔΔCt方法要求标准品和靶基因的效率相同。
无疑明显的问题是：可接受的偏差范围是多大？确定该范围的方法是采用同样的样本生成标准品基因和目的靶基因的标准曲线(图26)。
可获得每个稀释度的标准品和靶基因的平均ΔCt。
数值本身并不重要；重要的是各个稀释度的值的一致性。
对于一些研究人员而言，这些小的效率偏差仍可导致数据不准确。
采用目的基因和标准品校正可使扩增效率差异最小化。
相对定量算法——标准曲线法 相对定量的标准曲线法采用检测和校准样本的靶基因之间的Ct差异，利用参考基因Ct进行标准化，调整扩增效率的微小差异。
采用此方法需要利用标准曲线确定标准品和目的基因的扩增效率，但无需采用前面的技术的前提。
该技术要求所有分析样本中的标准品基因必须相同。
图25.处理样本和校准品中的表达相对定量。
处理样本和校准品重复运行 两次；校准品Ct为
6，处理样本为12。
根据ΔCt方法，计算得出的处理样本中靶基因的相对表达水平较校准品低64倍。
但由于未使用标准品，该结果 的实验差异效应未知，因此结论可靠性较低。
42 数据分析 在图27中， 倍数差异=(E靶点)ΔCt靶点/(E标准品)ΔCt标准品 E=标准曲线E的效率=10[-1/斜率] ΔCt靶点=CtGOIc-CtGOIs ΔCt标准品=Ct正常c-Ct正常s 倍数差异方程摘自
M.W.Pfaffl的A-ZofQuantitativePCR一书。
要获得最准确的效率值，应仔细选择标准曲线中的校准样本。
该校准样本应经过同样的纯化步骤，运行同样的反应，且复杂度与实验样本相当。
因此，最佳校准样本是含有目的靶点的异质性样本——例如，从待研究的细胞系或组织中提取的总RNA。
值得注意的是，校准样本和实验样本之间的任何差异均可导致效率校正不准确，从而使基因表达的倍数变化计算变得不准确。
由于无需检测拷贝数，因此可随意稀释。
该技术采用了与ΔΔCt方法相同的扩增曲线设置，结合标准曲线中的效率值(在同一块反应上运行)调整标准品和目的基因(GOI)Ct值。
利用上述两个斜率计算效率(图27)。
简而言之，选择定量策略的第一步是确定绝对定量或相对定量哪种能最好地解决问题。
如果您需要知道样本中有多少靶分子，则需要利用已知量的目标模板生成精确的标准曲线。
在大多数情况下，相对定量是首选的方法。
ΔCt方法未采用标准品，而ΔΔCt方法则利用一个或多个参考基因，对实时荧光定量PCR的处理差异进行标准化。
利用标准品可计算倍数变化(需要或不需要调整反应效率)。
图26.相对效率曲线。
ΔCt范围为2.0至2.5。
以稀释度或起始RNA量作图，获取斜率。
完美的直线(斜率=0)表示所有起始浓度的效率一致，采用 ΔΔCt方法时，斜率<0.1一般被视为可接受的范围。
4 图27.利用标准曲线获取效率值，调整标准品和目的基因Ct值。
HeLaRNA连续稀释6个数量级，进行实时荧光定量PCR，生成标准品和目的基因 (GOI)标准曲线。
43
4 数据分析 4.4高分辨率熔解曲线(HRM)分析 高分辨率熔解曲线(HRM)分析是一种全新的均匀闭管PCR后分析方法，适用于SNP、新型突变和甲基化图谱的鉴别。
HRM分析是一种较传统熔解曲线分型更灵敏的方法，它监测双链DNA解离为单链DNA的温度。
此温度称为Tm，或产物的熔解温度。
高分辨率熔解曲线分型需要具有高级光学和热学性能的实时荧光定量PCR仪和分析软件，用于实现超快数据采集和高度准确的热学控制和一致性。
QunatStudio™12KFlex、QunatStudio™6/7、ViiA™7、7900HTFast、7500Fast、StepOnePlus®和StepOne®实时荧光定量PCR系统、Rotor-Gene®6000系统(CorbettLifeScience)及LightCycle®480系统(RocheDiagnostics)是目前可用于HRM分析的商品化仪器。
在HRM分析中，在包含高性能双链DNA(dsDNA)结合染料的混合物中采用PCR扩增约80–250bp基因片段。
MeltDoctor™HRMMasterMix采用了MeltDoctor™HRM染料，它是一种热稳定型的荧光SYTO®9染料，在双链DNA存在的情况下具有低背景荧光和高亮度。
在40个循环之后，扩增产物退火，并发出大量荧光。
当HRM分析开始后，实时荧光定量PCR仪缓慢升温，同时记录扩增片段的荧光数据。
随着PCR产物开始变性(或熔解)，荧光染料释放，荧光强度慢慢下降，直到温度接近PCR产物的Tm。
在十分接近Tm时，随着样本从双链解离为单链DNA，可观察到荧光强度显著下降(图28)。
图28.PCR扩增片段的熔解曲线特性。
特定的DNA序列具有特征性的熔解曲线。
可通过Tm变化或熔解曲线形状的改变检测出突变。
与传统的熔解曲线分析不同，HRM可区分出单核苷酸差异的扩增片段。
该技术为dsDNA结合染料开创了诸多新应用领域。
采用传统方法，上述应用领域需要针对各个靶点的独特荧光探针，代价高昂、设计耗时费力，且不灵活。
采用dsDNA结合染料的HRM提供了与基于探针的分析同样的性能，且价格更低廉，形式灵活。
HRM分析应用领域 最广泛的HRM分析应用领域是基因筛查。
基因筛查是搜索PCR扩增片段中是否存在未知变异，它可在测序步骤之前进行或者作为替代测序方法。
由于PCR产物突变可导致DNA熔解曲线的形状改变，因此它可以利用HRM分析检测。
杂交双链DNA样本扩增并熔解时，其熔解曲线不同于纯合野生型或突变样本。
尽管HRM的应用领域很多，但单核苷酸水平的区分更具挑战性，因其必须检测出微小的Tm改变。
HRM分析试剂 除专业仪器和软件外，HRM分析还需要能够区分单个核苷酸差异的扩增片段熔点的dsDNA结合染料。
已成功应用于HRM分析的染料包括： 一些常见的HRM分析应用领域包括： •基因筛查(突变研究)•突变分析•单核苷酸多态性(SNP)检测•杂合性研究•物种鉴定•甲基化分析 •MeltDoctor™HRM染料(ThermoFisherScientific)•MolecularProbes®SYTO®9染料(LifeTechnologies ThermoFisherScientific)•LCGreen®和LCGreen®Plus+试剂(Idaho Technology)•EvaGreen®染料(BiotiumInc.) 44 HRM分析成功的关键 •设置合适的升温速率。
通常需要每一个Ct产生10-20个数据点用于HRM的分析。
•保持较短的扩增片段，实现最高的灵敏度。
与较大的扩增片段相比，100bp左右的扩增片段可简化单核苷酸熔解曲线的检测。
•确保PCR扩增片段的特异性。
错配产物和引物二聚体可使数据解释复杂化。
引物浓度低于200nM，MgCl2在1.5mM至3mM范围及使用热启动DNA聚合酶将有助于获得高特异性。
采用标准的低分辨率熔解曲线评估错配。
无模板对照(NTC)熔解曲线对特异性评估至关重要。
•避免扩增包含除目的基因外的其它差异基因的区域。
检查PCR产物的种属同源性、外显子/内含子边际、剪接位点及二级结构和折叠。
•所有待分析的靶点均维持相似的荧光平台及相似的PCR产物量。
待比较样本量的差异可影响熔解温度和混淆HRM分析。
采用类似的起始样本量十分有用。
•确保反应使用足够的模板。
一般而言，Ct应低于30，以生成足够的材料，实现准确的熔解分析。
•提供充分的熔解数据采集窗口。
例如，窗口应在扩增片段熔解温度的上下10°C范围内(Tm±10°C)。
需要足够的熔解前和熔解后温度数据，实现准确的曲线标准化和高重复相关度。
•对于一些仪器，我们还建议在扩增后加入50°C预维持步骤(但在熔解之前)，以确保所有产物已重新关联，并有利于杂交双链形成。
使用混合物(如MeltDoctor™HRMMasterMix)，实现目的基因片段的灵敏且无偏差扩增。
数据分析
4 45
4 数据分析 4.5多重实时荧光定量PCR分析 多重反应技术是在同一个实时荧光定量PCR反应中分析超过一个靶点。
利用一种特定的染料、靶点特异性的荧光探针或引物对结合物区分每个靶点。
多重反应常用于在同一反应中扩增标准品基因和目的基因。
理论上，某个反应中可扩增的靶点数仅受可被实时荧光定量PCR仪激发并检测的具有不同光谱的染料数限制。
但仍有其它实验障碍存在：反应中的不同引物对和/或探针不得相互作用，这些引物和探针需分享PCR组分，如dNTP和热稳定DNA聚合酶。
多重反应的优化时间较长，但具有几个显著的优点： •差异较小，一致性更高。
在同一管内对标准品和目的基因进行多重反应，消除了这两个靶点在不同(即便相邻)孔内扩增可出现的孔间差异。
•试剂用量更少，成本更低。
多重反应只需较少的反应即可分析相同数目的靶点。
•更高的通量。
利用每次实时荧光定量PCR反应及每个样本可分析更多的靶点。
多重反应分析成功的关键 成功的多重反应必须考虑下列多个因素： •引物和探针设计•试剂优化(包括引物浓度、靶点丰度、反应组分和荧 光基团/淬灭剂组合)•多重反应分析验证 引物和探针设计 引物和探针设计无疑是多重反应分析中最重要的因素。
随着反应复杂度的提高，引物和探针形成二聚体的可能性也随之升高，竞争反应组分将限制一个或多个靶点的扩增。
下面是一些尤其重要的因素，可实现性能最大化并最大程度抑制竞争效应： •保持较短的扩增片段。
引物设计的扩增区段在60bp至150bp范围内将提升反应效率。
•设计引物的Tm值差别在1°C范围内。
请记住，所有引物和探针将在同一个温度下退火。
错配的Tm将导致效率偏差。
•进行引物和探针设计BLAST搜索，确保其针对目的靶点的特异性。
•使用引物设计软件确定引物或探针序列是否容易形成二聚体。
一款免费的程序AutoDimer(由美国国家标准与技术研究院的
P.M.Vallone编制)可分析特定的多重反应中的所有引物设计，了解其是否容易形成二聚体。
另一款软件MultiplePrimerAnalyzer也可在ThermoScientific™网站上获得。
试剂优化 多重反应的关键问题是不同扩增靶点的试剂之间的竞争。
确保高扩增效率需要降低引物用量，或者提高所有组分的浓度，或两者兼具。
大多数的优化实验都是从测试不同引物浓度开始的。
引物浓度和靶点丰度 多重反应中各种扩增片段的数量各不相同，扩增效率同样如此。
限制更易扩增或丰度更高的靶点的引物浓度可提供一个公平竞争的平台。
例如，如果β-actin(高拷贝标准品)与低丰度靶点进行多重反应，则共享的反应组分可能在早期循环即已耗竭。
降低β-actin的用量可限制其扩增效率，使较低丰度的靶点更易于扩增。
一般而言，对于更高丰度的靶点，您应采用不使Ct延迟的最低引物浓度。
反应组分浓度 每个多重反应各不相同，但调整引物浓度的方法最有可能达到多重和单重反应Ct值的一致性。
也可增加TaqDNA聚合酶、镁离子和dNTP的用量，并增强缓冲液的强度来提高所有靶点的灵敏度和扩增效率。
46 数据分析 荧光基团/淬灭剂组合 多重反应中的报告荧光基团必须具有独特的光谱，使各荧光信号可在单个通道中分别检测。
采用适当的染料，实时荧光定量PCR仪激发和发射光学元件能够过滤任何一点由错误的荧光基团发出的荧光(这种干扰又称为重迭噪声)。
同样的，随着多重反应中探针数量的增加，各个双标记荧光探针的淬灭剂选择也变得越来越重要。
荧光淬灭剂(如TAMRA™染料，FAM™染料的一种常见淬灭剂)可在不同的波长释放荧光基团的能量。
在多重反应中，该染料的淬灭剂可在不同波长产生多个信号，增加了过滤及数据完整性的难度。
而Dark淬灭剂，如NFQ或QSY®淬灭剂，以热量而不是荧光的方式释放能量，从而降低了整体荧光背景。
根据您使用的仪器的检测能力，选择适当的多重反应染料组合。
验证多重反应分析 与单重实时荧光定量PCR分析一样，多重反应也应建立标准曲线，先评估多重反应中所有靶点的反应效率，然后运行分析。
此验证过程包括两个主要阶段：
1.验证各靶点的引物和/或探针，确定各自的效率。
这是引物和探针设计的初始评估。
2.优化多重反应分析的整体效率。
单独评估各个引物和探针组，确定设计和条件是否适用于此靶点。
这是通过连续稀释的标准曲线完成的，同样试图达到近100%的效率。
在各引物/探针组合经过功能验证后，继续进行多重反应优化。
值得注意的是，当对靶点进行多重反应时，单重反应的引物/探针浓度条件并非最佳。
构建多重反应检测板时，建议在条件允许的情况下每次添加一个靶点，而不是在第一次实验中整合所有靶点。
使用相同的标准曲线方法，结合所有引物和探针，针对各个稀释度进行多重反应。
将各个靶点的效率与其相应的单重实时荧光定量PCR反应效率相比较。
理论上，单重反应和多重反应的标准曲线变化极小。
如果多重反应靶点的反应效率变化超过5%或者超出90-110%的理想范围，则需要优化多重反应分析的引物/探针浓度或其它组分。
多重反应的Ct值应与单重反应相当，使反应的灵敏度不受影响。
4 47 疑难解析
5 5.1引言5.2常见问题 疑难解析 5059 5 49 疑难解析 5.1引言 实时荧光定量PCR分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果。
在研究新基因或改变分析参数时，必须对分析进行验证，并调整所需的反应。
该过程包括调整引物浓度、热循环温度和时间，然后通过标准曲线评估确定参数。
优化过程确实需要时间，但是所花的时间是值得的。
这样得出的分析结果不仅具有最高的灵敏度和最大的动态范围，而且效率高(与高准确度相关)，重复性好。
这些因素使数据具有可靠性，并最终为研究界所接受。
解决实时荧光定量PCR反应过程中出现的问题似乎令人畏缩。
但是，如果将适当的Assay设计考虑在内，实时荧光定量PCR的常见困难可归结为四个主要方面： •引物二聚体的形成•引物和探针的储存•实时荧光定量PCR的抑制和较低的反应效率•软件分析设置 引物二聚体的形成 当引物对之间的部分序列存在同源性时，可形成引物二聚体。
如果在PCR反应过程中引物退火形成二聚体，则TaqDNA聚合酶可延伸二聚体，形成长于原始引物的产物，它可导致循环过程中更易出现退火错误。
根据长度的不同，引物也可能出现自身折叠，由此与模板形成冲突。
反应的复杂性(尤其在多重反应过程中)可使上述不良影响发生的几率增加。
引物二聚体的形成是您在实时荧光定量PCR设计和验证过程中最常见的问题之
一，但在实时荧光定量PCR反应中解决该问题的途径很多。
在讨论如何解决之前，最重要的是了解为何应减少二聚体的形成。
引物二聚体引发的问题 引物二聚体对反应的影响在很大程度上取决于反应中采用的化学物质。
基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不是很大，这是由于在引物二聚体区域极少出现探针退火及断裂的现象。
此时，引物的竞争作用是需要考虑的主要问题。
另一方面，基于双链DNA结合染料的反应受引物二聚体的影响很大，这是因为染料的结合方式为非特异性的，由此可导致反应过程中监测到的荧光信号增强。
这可相应改变Ct值，使结果出现偏差。
外部信号是影响反应效率的最重要因素，而反应孔内的竞争作用也会对其产生直接的影响。
如前所述，较低的反应效率可使动态范围缩小，由此造成灵敏度下降。
最好在引物设计阶段就采取简单的预防措施，从一开始即避免二聚体的形成。
有几款免费工具可协助完成上述过程。
其中一种工具是AutoDimer(由美国国家标准与技术研究院的
P.M.Vallone编制)，它可以从理论上对引物对的序列进行分析，并标记出那些易形成二聚体的序列。
尽管以生物信息学为基础的引物设计可以降低二聚体形成的可能性，但仍需要通过实验对其进行监测。
确定是否存在引物二聚体 凝胶电泳是显示引物二聚体的一种极佳的方法。
如图29所示，引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100bp以下。
在PCR过程中，二聚体的形成与模板的退火及延伸之间存在竞争作用。
引物二聚体通常随模板的减少而增加。
单独采用凝胶电泳分析进行验证的缺点在于，其灵敏度最低仅达到纳克级，因此可能无法得出结果。
凝胶电泳分析的优势是当解离曲线(熔解曲线)数据同时可用时，产物的大小有助于对结果进行综合解释。
5 图29.琼脂糖电泳分析引物二聚体的形成。
热循环反应之前，核酸样本经系列稀释并与PCR反应液混合，相同体积的反应混合液加入琼脂糖凝胶，引物二聚体为胶底部的扩散装条带。
50 疑难解析
A B 图30.扩增曲线和熔解曲线中突出显示了特异性扩增(A)和引物二聚体效应(B)。
可利用NTC样本在扩增曲线中产生的信号和熔解曲线中多余的峰在图(B)识别出引物二聚体。
解离曲线，又称熔解曲线，是利用双链DNA结合染料获得的标准反应热廊线。
如果扩增具有极好的特异性，则实时荧光定量PCR板上每个反应孔的解离曲线将出现一个较窄的单峰。
引物二聚体的荧光强度较低，呈较宽的“波形”，显示其在70°C左右熔解。
出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。
如数据分析部分所述，若对解离曲线中是否存在引物二聚体有任何疑问，可将观察的结果与NTC反应孔相比较。
当模板不存在时，更易出现引物二聚体峰(图30)。
减少或去除引物二聚体 如果出现了引物二聚体，有许多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体。
1.首先是优化热循环条件，这主要是提高退火温度。
大多数情况下，两步循环(由95°C变性步骤直接进入60°C退火和延伸步骤)有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为60°
C。
2.可降低引物浓度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的帮助。
大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为200nM，但如有需要，可将浓度降至60nM。
3.镁的最佳浓度一般约为3mM。
高于此浓度易形成引物二聚体。
4.如果未对引物形成二聚体的倾向进行评估，则应补充评估并考虑重新设计(如有需要)。
通常情况下，最好使用热启动DNA聚合酶，并在冰上进行反应。
5.在理论上，针对同一靶点应同时检测多个引物组。
这实际上可以节省大量时间，因为如果这些引物中的一个能立即发挥作用，则可以减少花费在优化过程上的时间。
请记住，由于在引物对存在的情况下，RT反应的温度更低，因此二聚体在一步法qRT-PCR反应中可能更值得关注。
另外还须注意，有些情形下引物二聚体并不是一个值得担心的问题。
例如，如果只是在NTC孔里出现，或者样本孔和NTC孔的ΔCt值的差异是大于10(因为这表明来自引物二聚体的荧光信号可以忽略不计。
)
5 51
5 疑难解析 引物和探针的储存
A 尽管引物和探针的储存经常被忽略，但其在保证实时荧光 定量PCR分析的长期成功和一致性方面具有重要作用。
影响引物和探针的稳定性的主要因素是储存温度、储存时 间、是否被长时间暴光、储存的引物和探针的浓度以及储 存溶液的组分。
引物和探针储存不当引发的问题 引物和探针储存不当可导致降解及特异性丧失，进而对反
应效率造成影响。
在基于荧光标记的引物和探针的分析中，降解的探针可释放出游离染料，从而导致背景增加以及信噪比降低。
由于其荧光强度较低，因此上述现象可使扩增曲线显得极为粗糙。
附于引物和探针上的荧光染料也会逐渐发生光漂白作用，从而很难在实时荧光定量PCR仪中被检测出来。
确定引物或探针的完整性是否受到影响 确保引物和探针的稳定性的首要预防措施是对储存时间进行简单的监测。
大多数情况下，引物和探针的稳定性可达一年(或者更长时间)。
但储存条件不当时，可在6个月内观察到储存相关效应。
评估引物完整性的最佳方法是连续利用标准曲线。
复制不 准确及解离曲线中存在多个峰(尤其是以前未曾出现过的)
B 是稳定性降低的常见指征。
至于荧光标记的探针和引物，在仪器的多组分视图中观察到超过正常水平的背景荧光即可视为探针降解。
如果荧光探针和引物未降解而染料本身出现降解，当有产物形成但无法在实时荧光定量PCR仪中检测出来时，可通过溴化乙锭染色的凝胶显色。
图31中的标准曲线突出显示了储存不当的引物产生的效应。
图31A中的扩增曲线受到了降解引物的消极影响，而图31B中的曲线则是储存适当的引物的预期结果。
熔解曲线插图可提供更多详情，显示其中存在多种非特异性产物。
图31.扩增曲线分别显示了储存不当的引物(通过熔解曲线和背景荧光显示)(A)与储存适当的引物(B)产生的效果。
52 疑难解析 长期保持引物和探针的稳定性 保持引物和探针的稳定性的关键有四点。
低压冻干的引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。
引物一旦重新溶解，即应置于-20°C保存，且若保存时间超过一年则应对其进行监测，看它是否出现功能下降。
对于标记的引物和探针，则应采取措施避免标记物暴光(例如使用不透明管及置于暗处保存)，以延长它们的使用寿命。
最后，引物浓度也可影响其稳定性。
建议引物的储存浓度不低于10μM；实际上，在大多数情况下，100μM的引物浓度操作更简单。
引物和探针还应分装保存，以减少冻融次数，特别是标记的引物和探针。
最后，TE缓冲液可形成比水更为稳定的环境。
此外，含有0.1mMEDTA的TE缓冲液(标准TE中含有1mMEDTA)是一种理想的溶液，这是由于一些PCR反应对EDTA的灵敏度可能有一些残存。
NTC扩增 如前所述，当引物二聚体形成时，如果使用与DNA双链结合的染料，在NTC反应中也可观察到荧光信号。
也存在另一种情况，引物二聚体的扩增也会在NTC孔中被观察到。
无论是基于探针还是双链DNA结合染料的反应，在存在污染物的情况下，也可看到晚期扩增。
这可能是一种随机事件，并不是所有NTC都会出现扩增，通常是由不常见的加样错误引起。
如果在每一个NTC反应里都出现扩增，很可能是其中一种或两种试剂被污染了。
可采用以下步骤防止或去除污染。
1.使用干净的工作台，用带核酸降解试剂的的溶液擦抹工作台面。
2.用带dUTP和UDG的反应预混液降解来自前序PCR反应的产物，防止前序PCR反应的污染。
3.用新的反应管尽量通过置换不同来源的试剂，发现出现问题的试剂。
实时荧光定量PCR基础知识1实验设计2反应板制备3数据分析4疑难解析5数字PCR6 实时荧光定量PCR基础知识
1 实时荧光定量PCR基础知识 1.1简介1.2实时荧光定量PCR概述1.3实时荧光定量PCR组分概述1.4实时荧光定量PCR分析1.5实时荧光定量PCR荧光检测系统1.6熔解曲线分析1.7参比荧光染料1.8污染预防1.9多重实时荧光定量PCR1.10内部质控品和参考基因1.11实时荧光定量PCR仪校准
2 3
4 1
6 10 14 15 16 16 18 19
1 1 实时荧光定量PCR基础知识 1.1简介 聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学领域功能最强大的技术之
一。
采用PCR技术，利用序列特异性寡核苷酸、热稳定性DNA聚合酶和热循环，可将DNA或cDNA模板内的特异性序列拷贝或“扩增”数千至数百万倍。
在传统(终点)PCR中，扩增序列的检测和定量是在反应结束，即最后一次PCR循环完成后进行的，且需要PCR后分析，如凝胶电泳和图像分析。
在实时荧光定量PCR(qPCR)中，每次循环均检测PCR产物。
通过监测指数扩增期的反应，用户可以确定靶点的起始量，且精度极高。
在理论上，PCR可呈指数型扩增DNA，使每个扩增循环中的靶分子数倍增。
在PCR问世之初，科学家推断，通过与已知标准品进行比较，利用循环数和PCR终产物的量可以计算出遗传物质的起始量。
为达到可靠定量的要求，实时荧光定量PCR技术得以问世。
如今终点PCR主要用于扩增特定的DNA，用于测序、克隆及其它分子生物学技术。
在实时荧光定量PCR中，每次循环结束后通过荧光染料检测DNA的量，荧光染料产生的荧光信号与生成的PCR产物分子(扩增片段)数直接成正比。
利用反应指数期采集的数据，生成有关扩增靶点起始量的定量信息。
实时荧光定量PCR使用的荧光报告基团包括双链DNA(dsDNA)结合染料或在扩增过程中掺入PCR产物的、与PCR引物或探针结合的染料分子。
利用具有热循环功能及荧光染料筛查能力的仪器，检测反应过程中荧光的变化。
实时荧光定量PCR仪通过绘制荧光与循环数曲线，生成扩增曲线，表示在整个PCR反应过程中积聚的产物(图1)。
实时荧光定量PCR的优点包括： •能够实时监控PCR反应的进程•能够精确测定每个循环的扩增片段数量，从 而对样本中的起始材料量进行准确定量•具有更大的检测动态范围•在单管中实现扩增和检测，无需PCR后处理 在过去的数年中，实时荧光定量PCR已成为DNA或RNA检测和定量的主要工具。
采用上述技术，您可以实现精确的检测，其准确度低至2倍范围，起始材料的动态范围达6至8个数量级。
起始靶点 相对荧光 基线荧光 荧光阈值 循环数 图
1.相对荧光与循环数。
通过绘制每个样本的荧光信号与循环数曲线，生成扩增曲线；因此，扩增曲线表示在实时荧光定量PCR实验过程中积聚的产物。
用于创建本图曲线的样本是连续梯度稀释的DNA靶序列。
2 实时荧光定量PCR基础知识 1.2实时荧光定量PCR概述 本部分将概括实时荧光定量PCR的步骤。
实时荧光定量PCR是在标准PCR技术基础上演变而成，常用于定量样本中的DNA或RNA。
利用序列特异性引物，可测定特定的DNA或RNA序列的拷贝数。
通过检测PCR循环的每个阶段中扩增产物的量，实现定量。
如果样本中存在高丰度的特定序列(DNA或RNA)，则在早期循环中即可观察到扩增；如果序列较少，则在晚期循环中方可观察到扩增。
利用荧光探针或荧光DNA结合染料，采用实时荧光定量PCR仪检测荧光并完成PCR反应所需的热循环，实现扩增产物的定量。
实时荧光定量PCR的步骤 实时荧光定量PCR反应的每个循环包括三个主要步骤。
一般运行40个循环。
1.变性：利用高温孵育将双链DNA“熔解”为单链，并松开单链DNA的二级结构。
一般采用DNA聚合酶可耐受的最高温度(通常为95°C)。
如果模板GC含量较高，则延长变性时间。
2.退火：在退火过程中，互补序列有机会发生杂交，因此，应根据计算所得的引物熔解温度(Tm)，使用适当的温度(通常较引物的Tm低5°C)。
3.延伸：在70-72°C之间，DNA聚合酶的活性最佳，引物延伸速度达每秒100个碱基。
当实时荧光定量PCR中的扩增片段较小时，通常将该步骤与退火步骤合并，温度为60°
C。
两步法qRT-PCR 两步法定量逆转录PCR(qRT-PCR)的第一步是采用逆转录酶(RT)将总RNA或poly(A)RNA逆转录为cDNA。
采用随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物(GSP)完成第一链cDNA合成反应。
为在实时荧光定量PCR应用中平均表示所有靶点并避免oligo(dT)引物的3’偏差，许多研究人员采用了随机引物或oligo(dT)和随机引物的混合物。
cDNA合成采用的温度取决于所选的RT酶。
逆转录完成后，将约10%的cDNA转移至单独的管中，完成实时荧光定量PCR反应。
一步法qRT-PCR 一步法qRT-PCR可在同一管内完成第一链cDNA合成反应和实时荧光定量PCR反应，简化了反应设置，并降低了污染的可能性。
需要使用基因特异性引物(GSP)。
这是由于在一步法操作中使用oligo(dT)或随机引物将生成非特异性产物，降低了目的产物的量。
1 3
1 实时荧光定量PCR基础知识 1.3实时荧光定量PCR组分概述 本部分将概括实时荧光定量PCR实验的主要反应组分和参数。
在本手册后面的部分，将更详细地介绍一些特殊的组分，如报告基团染料、参比荧光染料和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。
DNA聚合酶 PCR的性能通常与热稳定性DNA聚合酶有关，因此酶的选择是反应成功的关键。
影响PCR特异性的一个主要因素是TaqDNA聚合酶在低温下具有残留活性。
在反应的设置中，引物可与DNA非特异性地退火结合，使得聚合酶合成非特异性产物。
通过采用“热启动”酶，可最大程度地减少因引物错配形成非特异性产物的问题。
采用热启动酶确保了在反应设置过程和初始DNA变性步骤中，DNA聚合酶无活性。
逆转录酶 逆转录酶(RT)同DNA聚合酶一样，亦是qRT-PCR成功的关键。
选择一种不仅能够提供高全长cDNA产量且在高温下具有良好活性的RT至关重要。
高温性能对于具有二级结构的RNA的变性同样极为重要。
在一步法qRT-PCR中，可在较高温度下维持活性的RT使您能够使用具有高熔解温度(Tm)的GSP，提高了特异性，降低了背景。
dNTP 最好从同一供应商那里购买dNTP和热稳定性DNA聚合酶，因为在实验中使用不同供应商的试剂，常常会出现阈值循环(Ct)灵敏度下降的情况。
镁离子浓度 在实时荧光定量PCR中，氯化镁或硫酸镁的终浓度一般为3mM。
这是大多数靶点的最佳工作浓度；但镁离子的最佳浓度范围为3至6mM。
良好的实验技术 不要低估良好的实验技术的重要性。
反应的每个阶段(从模板制备到PCR后分析)最好使用专门的设备和解决方案。
使用防气溶胶吸头和螺帽管有助于减少交叉污染问题。
要获得严格的重复数据(理论上为三次重复)，需制备包含除样本外的所有反应组分的预混液。
使用预混液可减少加样步骤，从而降低孔间污染及其它加样误差的几率。
模板 每次实时荧光定量PCR反应需使用10至1,000拷贝的模板核酸。
这相当于大约100pg至1μg的基因组DNA或利用1pg至100ng总RNA生成的cDNA。
多余的模板也可能提高污染物含量，大大降低PCR效率。
PCR引物的特异性针对cDNA而非基因组DNA，处理RNA模板以降低其包含基因组DNA污染的几率十分重要。
一种方案是采用DNA酶I处理模板。
纯的完整RNA是高质量全长cDNA合成的基础，也是实现准确的mRNA定量的关键。
RNA应避免RNA酶污染，且应维持无菌状态。
总RNA一般适用于qRT-PCR；通常无需mRNA提取，但提取mRNA可提高特定cDNA的产量。
4 实时荧光定量PCR基础知识 实时荧光定量PCR引物设计 良好的引物设计是实时荧光定量PCR的最重要参数之
一。
这正是众多研究人员选择购买TaqMan®Assay产品的原因——这些引物和探针采用了成熟可靠的算法设计，获得了全世界科学家的信赖，适用于实时荧光定量PCR。
如果您选择设计您自己的实时荧光定量PCR引物，切记扩增片段的长度应约为50–150bp，因为较长的产物无法实现高效扩增。
一般而言，引物的长度应为18–24个寡核苷酸。
这是针对实际的退火温度的。
引物应根据标准PCR指南设计。
它们对于目的基因序列应是特异性的，且无内部二级结构。
引物应不含共聚物延伸段序列(如poly(dG))或重复基序，因其可引起不必要的杂交。
引物对应具有相当的熔解温度(在1°C以内)，且GC含量约为50%。
高GC含量的引物可形成稳定的不良杂合体。
相反，高AT含量会降低匹配良好的杂合体的Tm值。
如果可能，引物的3’端应具有高GC含量(GC夹)，以提升延伸端的退火效率。
分析引物对序列，避免引物之间的互补和杂交(引物二聚体)。
在qRT-PCR中，设计内含子两侧可与外显子退火结合的引物(或覆盖mRNA相邻两个外显子交界处)，利用熔解曲线分析区分cDNA和潜在污染基因组DNA的扩增。
要确认引物的特异性，可在公共数据库上进行BLAST搜索，以确保您的引物只识别目的靶点。
想获得最佳结果，需要在50至500nM浓度间进行引物滴定。
引物终浓度为200nM时能有效地进行大多数的实验。
引物设计软件 引物设计软件程序(如OligoPerfect™设计工具和PrimerExpress®软件)及序列分析软件(如VectorNTI®软件)可自动评估目的序列，并根据上述标准设计序列引物。
使用引物设计软件至少可以确保引物针对目的序列的特异性，且不会形成内部二级结构，并能避免每条引物的3’端自身或与其它引物之间形成互补杂交。
如前所述，在使用DNA结合染料进行扩增片段检测时，良好的引物设计尤为关键。
1 5
1 实时荧光定量PCR基础知识 1.4实时荧光定量PCR分析 本部分定义了实时荧光定量PCR分析中常用的术语。
基线 实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中(一般为第3至15个循环)的信号水平，此阶段的荧光信号变化极小。
低水平的基线信号相当于反应的背景或“噪声”(图2)。
每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析，根据经验确定。
应仔细设置基线，以准确确定阈值循环(Ct)(定义如下)。
基线确定应考虑足够的循环数，消除扩增早期的背景，但应排除扩增信号开始超过背景的循环。
当比较不同的实时荧光定量PCR反应或实验时，应采用同样的方法确定基线(图2)。
标准曲线 利用连续稀释的已知样本建立标准曲线，确定实验样本的目的模板起始量，或者评估反应效率(图4)。
以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标(x轴)，该浓度对应的Ct值为纵坐标(y轴)，绘制曲线。
从该标准曲线中可以推导出反应性能及各种反应参数(包括斜率、y截距和相关系数)相关的信息。
标准曲线中所选的浓度应涵盖实验样本的预期靶点浓度范围。
阈值 实时荧光定量PCR反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加(图2)。
设置阈值可将相关扩增信号从背景中区分出来。
实时荧光定量PCR仪软件通常将阈值自动设置为基线荧光值标准差的10倍。
但阈值可设置在PCR指数期的任意点。
Ct(阈值循环) 阈值循环(Ct)是反应的荧光信号与阈值交叉的循环数。
Ct值可用于计算起始DNA拷贝数，因为Ct值与起始靶点量呈反比。
例如，比较含有不同靶点量的样本的实时荧光定量PCR结果时，如果第一个样本扩增前起始的靶基因拷贝数是后一个样本的两倍，较之第二个样本，第一个样本可提早一个循环生成Ct(图3)。
前提是上述两个反应的PCR的工作效率均为100%(即每个循环后产物量均实现倍增)。
模板量越低，出现明显扩增的循环数越高。
模板按10倍稀释，则Ct值递减3.3个循环。
阈值 基线 循环数 图
2.实时荧光定量PCR反应的基线和阈值。
图3.10倍连续稀释的扩增曲线。
6 实时荧光定量PCR基础知识 图
4.实时荧光定量PCR数据的标准曲线示例。
标准曲线的y轴表示阈值循环(Ct)，x轴表示起始RNA或DNA靶点量。
斜率、y-截距和相关系数值可用于提供反应性能相关的信息。
相关系数(R2) 相关系数可用于表示数据与标准曲线之间的契合度。
R2值反映了标准曲线的线性度。
在理论上，R2=
1，但0.999一般为最大值。
Y-截距 y-截距表示反应的理论最低检测限，或者x轴上的最低拷贝数的靶分子产生明显扩增时的预期Ct值。
尽管PCR在理论上能够检测单拷贝靶点，但在实时荧光定量PCR应用中能可靠定量的最低靶点量通常为2–10拷贝。
这限制了y-截距值直接反映灵敏度的作用。
但y-截距值可用于比较不同的扩增系统和靶点。
指数期 在指数期的早期，而不是指数期的晚期或反应达到平台时进行实时荧光定量PCR反应定量十分重要。
在指数期的开始，所有试剂仍有剩余，DNA聚合酶仍然高效，扩增产物的量较少，不会竞争引物的退火性能。
所有这些均可提高数据的准确度。
斜率 扩增反应的对数线性期的斜率可用于检测反应效率。
要获得准确且可重复的结果，反应效率应尽可能接近100%，相当于斜率为-3.32(参见下文效率，了解更多详情)。
效率 100%的PCR效率对应的斜率为-3.32，可根据下列等式确定： 效率=10(-1/斜率)-
1 理论上，PCR反应的效率(E)应为100%，表示在指数扩增阶段每次热循环后的模板倍增。
实际效率可提供反应相关的重要信息。
诸如扩增片段的长度、二级结构和GC含量等实验因素会影响效率。
影响效率的其它条件有反应本身的动态范围、使用的试剂浓度未达到最佳以及酶的质量，这些因素均会导致效率低于90%。
一种或多种试剂中存在的PCR抑制剂可使其效率超过110%。
良好的反应效率应在90%至110%之间，其对应的斜率为-3.58至-3.10。
动态范围 在此范围内，起始材料的浓度增加，扩增产物也相应增加。
理论上，质粒DNA的实时荧光定量PCR的动态范围应为7-8个数量级，cDNA或基因组DNA至少为3–4log范围。
绝对定量 绝对定量是指在实时荧光定量PCR实验中，对已知量的样本进行连续稀释后扩增，生成标准曲线。
然后通过与此曲线比较，定量未知样本。
相对定量 相对定量是指在实时荧光定量PCR实验中，将一个样本(已处理)中的目的基因表达与另一个样本(未处理)中相同基因的表达相比较。
结果以处理样本的表达量相对于未处理样本表达量的倍数变化(增加或减少)表示。
此类型的定量采用标准品基因(如β-actin)作为实验差异对照品。
1 7
1 实时荧光定量PCR基础知识 熔解曲线(解离曲线) 熔解曲线图示了随着反应温度的升高，当结合染料分子的双链DNA(dsDNA)解离或“熔解”成单链DNA(ssDNA)时，观察到的荧光强度的变化。
例如，当加热结合有SYBR®GreenI染料的双链DNA时，其达到熔点(Tm)后，由于DNA链的解离和染料的释放，检测的荧光强度会出现突然下降。
绘制荧光强度与温度图(图5A)，及-ΔF/ΔT(荧光变化/温度变化)与温度图，清晰显示熔解曲线动态范围(图5B)。
扩增后熔解曲线分析是一种简单、直接地检查实时荧光定量PCR反应中引物二聚体结构的方法，可确保反应的特异性。
由于核酸的熔解温度受长度、GC含量以及是否存在碱基错配等因素影响，不同的PCR产物通常可根据其熔解特性区分。
通过熔解曲线分析鉴定反应产物(如引物二聚体与扩增片段)省去了耗时的凝胶电泳步骤。
图6所示的典型的实时荧光定量PCR数据组显示了上文提及的多个术语。
图6A显示了典型的实时荧光定量PCR扩增曲线。
在早期PCR反应循环中，荧光信号变化极小。
随着反应的进行，每个循环的荧光水平开始增加。
将反应阈值设置在基线之上、曲线的指数期部分。
该阈值可用于指定每个扩增反应的阈值循环或Ct值。
利用一系列含有已知量靶点的反应的Ct值生成标准曲线。
将未知样本的Ct值与此标准曲线相比较进行定量，或者在相对定量时采用标准曲线检验效率。
Ct值与起始模板量呈反比：反应中的起始模板量越高，反应的Ct值越低。
图6B显示了利用扩增曲线的Ct值生成的标准曲线。
标准曲线提供了扩增效率、重复一致性及反应的理论检测限等信息
A.B.图
5.熔解曲线(A)和-ΔF/ΔT与温度(B)。
8 实时荧光定量PCR基础知识
A. 1
B. 图6.1.25x103至2x104个拷贝的RNA酶P扩增。
在ViiA™7实时荧光定量PCR系统的标准热循环条件下，采用FAM™染料标记的TaqMan®Assay及TaqMan®UniversalMasterMixII对2倍连续稀释的人RNA酶PDNA进行实时荧光定量PCR反应。
(A)扩增曲线。
(B)标准曲线显示了模板拷贝数与阈值(Ct)。
9 1 实时荧光定量PCR基础知识 1.5实时荧光定量PCR荧光检测系统 实时荧光定量PCR化学原理 实时荧光定量PCR试剂的种类很多，但最常用的是5’核酸酶Assay，例如TaqMan®Assay和基于SYBR®Green染料的Assay(图7)。
5’核酸酶Assay以TaqDNA聚合酶的5’核酸酶活性命名(图8)。
5’核酸酶结构域能够在DNA合成结束后，降解与模板结合的DNA。
5’核酸酶Assay的第二个关键元件是一种称为FRET的现象：荧光共振能量转移(fluorescentresonanceenergytransfer，FRET)。
在FRET中，邻位的另一种染料——通常被称为淬灭剂——可大大降低荧光染料的发射信号。
可通过两种荧光染料对FRET进行图示说明：绿色和红色(图9)。
绿色荧光染料的发射光能量较红色荧光染料更高，这是由于绿光的波长比红光短。
如果红色染料邻近绿色染料，则激发绿色染料将导致绿光的发射能量被转移至红色染料上。
换言之，能量从高处转移至低处。
继而绿色染料的信号将被抑制或“淬灭”。
但如果两种染料相距较远，则不会出现FRET现象，绿色染料能发射出全部信号。
用于靶点检测或定量的5’核酸酶Assay通常包括两个PCR引物和一个TaqMan®探针(图10)。
在PCR开始之前，TaqMan®探针完整且具有一定的灵活性。
探针完整时，报告基团和淬灭剂之间具有天然的亲和力，可促进FRET的发生(图11)。
在PCR开始之前，报告基团信号被淬灭。
在PCR过程中，引物和探针与靶点退火结合。
DNA聚合酶延伸探针上游的引物。
如果探针与正确的靶序列结合，则聚合酶的5’核酸酶活性会切断探针，释放出含有报告基团染料的片段。
剪切完成后，报告基团和淬灭染料不再相互吸引；释放的报告基团分子将不再被淬灭。
图7.5’核酸酶Assay。
图
8.TaqDNA聚合酶图示。
每个不同颜色的球表示一个蛋白质结构域。
图
9.FRET现象举例。
(A)当绿色荧光染料与红色荧光染料靠近时可出现FRET。
(B)当两种荧光染料相距较远时，不会出现FRET。
5’核酸酶Assay特异性 Assay特异性是指Assay结果中包括靶点信号且排除非靶点信号的程度。
特异性可以说是任何一个Assay中最重要的方面。
影响5’核酸酶Assay特异性的最重要因素是同源物。
同源物是与靶点序列相似的基因，但不是Assay的目的靶点。
同源物在种属内部及相关种属之间极为常见。
10 实时荧光定量PCR基础知识 图10.TaqMan®探针。
TaqMan®探针具有基因特异性序列，可与两个PCR引物之间的靶点结合。
TaqMan®探针的5’端带有“报告基团”，该荧光染料将报告靶点的扩增。
探针的3’端为淬灭剂，它可以淬灭完整探针中报告基团发出的荧光。
淬灭剂还将阻断探针的3’端，这样即无法在热稳定性DNA聚合酶作用下延伸。
图11.TaqMan®探针图示。
R为报告基团染料，Q为淬灭剂分子，橙色的线条表示核苷酸。
1 5’核酸酶Assay提供了两种特异性工具：引物和探针。
靶点与同源物之间的错配发生在引物的3’最末端的碱基对引物的特异性影响最大，而远离3’末端的错配对特异性影响较小。
而发生在TaqMan®MGB探针(较TaqMan®TAMRA™探针短)大部分位置上的错配对特异性的影响极大——TaqMan®MGB探针是比引物更有效的实现特异性工具。
例如，引物结合位点上的一个或两个碱基的随机错配将极有可能使DNA聚合酶高效延伸与同源物结合的引物。
DNA聚合酶作用下的一个或两个碱基的延伸将稳定与同源物结合的引物，因此其结合的稳定性同引物与完全互补的目的靶点的结合相当。
此时，DNA聚合酶将继续合成，生成同源物的拷贝。
在TaqMan®探针3’端的淬灭剂的作用下，DNA聚合酶无法稳定5’端的错配。
TaqMan®MGB探针结合位点上的错配将降低探针结合的紧密度，这样探针不会被剪切，而是整个探针被置换。
整个探针回到其淬灭结构，当PCR循环结束采集数据时，信号由靶点而非同源物产生，即便同源物亦扩增，也不会产生信号。
除同源物外，PCR还可扩增非特异性产物，这是引物与样本DNA的随机位点结合或者引物自身结合(称为“引物二聚体”)产生的。
由于非特异性产物与靶点无关，因此它们无TaqMan®探针结合位点，在实时荧光定量PCR数据中不可见。
TaqMan®探针类型 TaqMan®探针可分为两种类型：MGB和非MGB。
第一款TaqMan®探针属于“非MGB”。
它们采用TAMRA™染料作为淬灭剂。
在实时荧光定量PCR发展的早期，大量测试显示，TaqMan®探针所需的退火温度远高于PCR引物的温度，因而无法完成剪切。
因此，TaqMan®探针的长度要大于引物。
这种长探针上出现一个碱基错配对探针结合的影响相对较小，可完成剪切。
但对于很多遗传复杂性较高的应用领域，如真核基因表达和单核苷酸多态(Singlenubleotidepolymorphisms，SNP)，则需要更高的特异性。
TaqMan®MGB探针是在TaqMan®探针技术基础上进一步改良而成的。
TaqMan®MGB探针的3’端带有小沟结合物(MGB)分子。
探针与靶点结合后，DNA内形成较短的小沟，使MGB分子结合，提高了熔解温度；从而增强了探针的结合。
TaqMan®MGB探针的长度可以大大短于PCR引物。
由于MGB基团的存在，这些探针可以较TaqMan®探针更短，同时能够达到较高的熔解温度。
与引物相比，TaqMan®MGB探针能在更高的温度下，与靶点更特异性地结合。
TaqMan®MGB探针更短，一个碱基的错配对其结合的影响更大。
由于TaqMan®MGB探针具有更高的特异性，因此其被推荐用于大多数遗传复杂性高的应用领域。
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1 实时荧光定量PCR基础知识 TaqMan®探针信号产生 无论您选择MGB还是非MGB探针，其信号图谱均相同。
在早期PCR循环中，只能检测到较低的淬灭报告基团信号。
在实时荧光定量PCR软件中，这些早期数据被自动消减为零，称为“基线”。
如果样本含有靶点，则最后将生成足够量的剪切探针，使扩增信号高于基线。
扩增信号变得可见的时间点与初始靶点量呈反比。
SYBR®Green染料 SYBR®GreenI染料是一种荧光DNA结合染料，可与双链DNA的小沟结合。
激发与DNA结合的SYBR®Green染料可产生较未结合染料更强的荧光信号。
基于SYBR®Green染料的Assay一般包括两个PCR引物。
在理想状态下，SYBR®GreenAssay的扩增图谱与基于TaqMan®探针的Assay类似。
在早期PCR循环中，可观察到水平基线。
如果样本中存在靶点，则在某个时间点将生成足够的PCR产物，使扩增信号变得可见。
SYBR®GreenAssay的特异性 Assay特异性测试对所有Assay都十分重要，尤其是那些容易遇到特异性问题的Assay。
SYBR®GreenAssay不具有TaqMan®探针的特异性，因此更容易出现特异性问题。
SYBR®Green染料将与扩增产物、靶点或非靶点结合，所有这些信号经过汇总后可生成一条扩增曲线。
SYBR®Green扩增曲线的形状无法用于特异性评估。
不论扩增的是靶点、非靶点还是混合物，曲线外观几乎相同。
SYBR®GreenAssay产生的扩增不应被理解为大部分信号源自靶点。
不同样本之间的非靶点扩增有所差别，每个SYBR®Green反应都应完成至少一种类型的特异性评估。
最常用的评估是解离分析。
SYBR®Green染料解离 SYBR®Green解离是采用SYBR®Green完成PCR反应后，PCR产物逐渐熔解。
解离是一种极佳的特异性评估方法，它无需额外的实验成本，在PCR反应容器内即可进行。
但解离延长了热循环实验方案，需要额外的分析时间，同时具有一定的主观性，且分辨率有限。
SYBR®Green解离的概念是，如果靶点是一个确定的基因序列，则应具有一个特定的熔解温度(Tm)，可用于帮助样本中的靶点鉴别。
一些非靶点产物的Tm值与靶点相差较大，从而实现了非靶点扩增的检测。
在最后的PCR循环完成后，增加解离实验方案。
完成熔解过程后，实时荧光定量PCR软件将绘制数据的一阶导数的负值，使熔解曲线变为单峰。
靶点峰的准确鉴别取决于纯靶点的扩增。
很多样本(如RNA和基因组DNA)具有较高的遗传复杂度，有利于非靶点的扩增，同时抑制了靶点扩增，在某些情况下甚至改变了熔解峰的形状。
研究人员采用纯的靶点作为起始材料，能够在扩增后将Tm峰和形状与特定的靶点相关联。
应只观察到单峰。
假定靶点峰应窄而对称，无不规则形状，如肩、驼峰或分割。
这些不规则的形状说明生成了Tm值相当的多个产物，使人对反应的特异性产生怀疑。
出现不规则解离的孔应从进一步分析中省去。
SYBR®Green解离的分辨率较低，且无法区分Tm值相当的靶点和非靶点，如同源物。
因此窄而对称的单峰不应确定为靶点或者某种产物，需额外的支持信息。
应评估每个可以观察到扩增的孔的解离数据。
如果样本中包含的峰无法对应纯的靶点峰，则结论是反应中未检测到靶点。
如果样本中包含的峰似乎与Tm值及纯靶点峰的形状匹配，则反应中可能有靶点扩增。
利用单独的解离曲线无法获得确定的结果，但当其与其它信息相结合(如阴性靶点样本、序列或凝胶)，则可提高特异性的可信度。
12 实时荧光定量PCR仪 实时荧光定量PCR仪有许多不同的模式。
每种模式必须有一个用于激发荧光染料的激发光源，及用于检测荧光发射值的检测器。
此外，每种模式还必须有一台PCR仪。
热循环模块可以是固定的(如StepOnePlus®系统)，也可以是用户可更换的(如ViiA™7系统、QuantStudio™6和7Flex系统、QuantStudio™12KFlex系统)。
有多种模块可供选择，能够容纳各种PCR反应容器：48孔板、96孔板、384孔板、384微孔Card、3072通孔反应板等。
所有的实时荧光定量PCR仪均附带软件，用于数据采集和分析。
染料区分 大多数实时荧光定量PCR反应含有多种染料，包括一个或多个报告基团染料，有时包括淬灭剂染料，以及极为常用的参比荧光染料。
同一个孔内的多个染料可以单独检测，亦可通过优化的激发光和发射光滤光片组合或者一种称为多组分算法的过程检测。
多组分算法是一种检测反应中每种染料的染料强度的数学方法。
多组分算法具有诸多优点，它可轻松校正染料指示错误，无需硬件调整即可将光学性能恢复至出厂标准，并提供了疑难排除信息来源。
实时荧光定量PCR基础知识
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1 实时荧光定量PCR基础知识 1.6熔解曲线分析 熔解曲线分析和检测系统 熔解曲线分析只适用于扩增片段上保留荧光基团的实时荧光定量PCR检测技术。
采用SYBR®GreenI或SYBR®GreenER™染料的扩增可进行熔解曲线分析。
双重标记探针检测系统(如TaqMan®探针)不适用，因为该系统可在PCR过程中剪切并释放荧光基团至溶液中，产生不可逆的信号变化；但该方法具有更高的特异性，因此不会带来严重的影响。
SYBR®GreenI和SYBR®GreenER™染料与dsDNA结合后，荧光水平大幅增加。
通过监测dsDNA的熔解将会观察到，随着DNA变为单链且染料从DNA上解离，荧光强度逐渐下降。
熔解曲线分析的重要性 实时荧光定量PCR分析的特异性取决于使用的引物及反应条件。
但即便是设计极佳的引物亦可能形成引物二聚体或扩增出非特异性产物(图12)。
当包含基因组DNA的RNA样本进行qRT-PCR时，基因组DNA也有可能被扩增。
可采用熔解曲线分析确认实时荧光定量PCR反应的特异性。
当无法进行熔解曲线分析时，必须更加注意不同反应之间观察到的Ct值差异是否有效，且不是由于存在非特异性产物造成的。
熔解曲线分析和引物二聚体 当两个PCR引物(同义引物或正义和反义引物)相互结合，而非与靶点结合时，即形成引物二聚体。
引物二聚体的熔解温度较扩增片段更低，采用熔解曲线分析可鉴别是否存在引物二聚体。
包含模板的样本中最好无引物二聚体存在，因其会降低PCR效率并影响分析。
无模板对照(NTC)中最易形成引物二聚体，因其中包含大量的引物且无模板存在。
NTC中存在引物二聚体时，用户应注意包含模板的反应中也可能有引物二聚体存在。
如果NTC中存在引物二聚体，则应重新设计引物。
对NTC的熔解曲线分析，可以将引物二聚体与由试剂组分中污染的核酸造成的假性扩增区分开来。
如何进行熔解曲线分析 要进行熔解曲线分析，应对实时荧光定量PCR仪进行编程，在热循环实验方案结束后显示熔解曲线。
扩增完成后，仪器将重新加热您的扩增产物，为您提供完整的熔解曲线数据(图13)。
大多数实时荧光定量PCR仪平台已将该特性整合至其分析软件包内。
图12.熔解曲线分析可用于检测是否存在非特异性产物(如引物二聚体)，如图所示，熔解曲线中扩增产物峰的左侧有其它的峰。
图13.AppliedBiosystems®仪器上的熔解曲线热学特性设置示例(快速加热至94°
C，变性DNA，然后冷却至60°C)。
14 实时荧光定量PCR基础知识 1.7参比荧光染料 在实时荧光定量PCR中，参比荧光染料常用于报告基团染料荧光信号的标准化，以及非PCR相关的荧光波动的校正。
需要通过标准化校正反应浓度或体积变化引起的孔间波动，并校正仪器扫描差异。
大多数实时荧光定量PCR仪采用ROX™染料作为参比荧光染料，这是因为ROX™染料不会对实时荧光定量PCR反应产生影响，且可将其荧光信号与其它报告基团或淬灭染料区分开来。
其中的例外是Bio-RadiCycleriQ®仪器系统，它采用荧光素作为参比荧光染料。
参比荧光染料 基于ROX™染料的参比荧光染料可用于其兼容的仪器(如AppliedBiosystems®仪器)上的实时荧光定量PCR中荧光报告基团信号的标准化。
使用参比荧光染料可高效实现荧光报告基团信号的标准化，且无需修改仪器的默认分析参数。
TaqMan®实时荧光定量PCR预混液中含有参比荧光染料，可作为内部参照用于： •非PCR相关的荧光波动的标准化(例如由加样误差引起的) •机器“噪声”引起的荧光波动的标准化•仪器激发和检测差异补偿•为多重实时荧光定量PCR和qRT-PCR提供稳定的 基线 荧光素参考染料 Bio-RadiCycler®仪器需要在每次运行之前采集“孔间差异因子”，补偿仪器或加样的不一致性。
采用SYBR®GreenI或SYBR®GreenER™染料进行的实验，需利用其它荧光基团——荧光素——来计算孔间差异因子。
采用每孔含有荧光素染料的单独的反应板(外部孔间差异因子)，或者将荧光素加入实时荧光定量PCR预混液中进行反应板内部校正(动力学孔间差异因子)，采集孔间差异因子。
当您每次采用iCycler®仪器开始运行前，必须选择方法。
iCycler®iQ™5和MyiQ™系统可将外部孔间差异因子读数数据保存为单独的文件，供后续读数参考。
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1 实时荧光定量PCR基础知识 1.8污染预防 与传统PCR一样，实时荧光定量PCR反应也受到核酸污染，从而导致假阳性结果。
可能的污染源有： •样本间的交叉污染•实验室设备的污染•前次PCR扩增产物和引物残余污染。
这是假阳性 PCR结果的主要来源 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG) 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)可通过防止前次反应的DNA的扩增，减少或阻止PCR反应之间的DNA残余污染。
在PCR反应中使用UDG可减少假阳性，从而提高实时荧光定量PCR反应的效率和数据的可靠性。
UDG防止残余污染的原理 UDG防止残余污染源于在实时荧光定量PCR预混液中采用dUTP替代dTTP。
然后再用UDG处理后续的实时荧光定量PCR反应预混液，降解污染的含有尿嘧啶的PCR产物，保留天然(含有胸腺嘧啶)的靶DNA模板。
采用标准UDG，先在50°C下短暂孵育，然后进行PCR热循环，使酶能够剪切污染DNA中的尿嘧啶残基。
去除尿嘧啶碱基可引起DNA断裂，防止其在PCR中用作模板。
UDG随后在PCR中升温至95°C灭活。
我们还可提供热不稳定性酶，它在50°C下即可灭活，适用于一步法qRT-PCR反应预混液。
1.9多重实时荧光定量PCR 多重反应简介 PCR多重反应是指在同一个反应中实现两个或更多基因序列的扩增和特异性检测。
要获得成功，PCR多重反应必须能够生成针对目的序列的足够的扩增产物。
多重实时荧光定量PCR可同时产生定性和定量的结果。
对于定量多重PCR，所有的目的序列的扩增必须能产生足够的几何期即对数期的信号。
对于定性结果，如果扩增产物足够，也可利用终点检测方法(如凝胶电泳)检测所有目的序列。
实时荧光定量PCR多重反应可用于生成定性或定量结果。
要完成实时荧光定量PCR多重反应，所有目的序列都必须生成足够的几何相信号。
后缀“plex”可用于多个术语。
单重(Singleplex)反应是一种旨在扩增单个基因序列的分析。
双重(Duplex)反应是两个PCR反应的组合，旨在同时扩增两个基因序列。
多重反应最常见的类型是双重反应，它是在同一孔内进行靶基因和对照或标准品基因序列分析；多于两重的更多重的反应也是可实现的。
一些商品化的实时荧光定量PCR试剂盒就是作为多重反应进行设计和验证的。
例如，MicroSEQ®
E.ColiO157:H7试剂盒采用了内部阳性对照和大肠杆菌靶点多重反应。
在研究应用领域，通常由科学家来选择采用哪种多重反应分析，并负责多重反应的验证。
在考虑是否建立多重反应分析时，权衡多重反应与所需的验证工作的利弊至关重要。
多重反应的优点 多重反应的三个优点：更高的通量(每块反应板可分析更多样本)、更低的样本用量和试剂用量——取决于实验中的靶点数。
例如，如果定量实验中只包括一个靶点分析，在同一反应中加入标准品分析，如内参，进行双重反应靶点分析将提高2倍的通量，同时每个样本减少一半的样本用量和试剂用量。
但如果定量实验包括两个靶点分析，可将两个靶点反应与一个标准品反应组合成三重反应。
在这种情况下，样本用量和试剂用量将进一步降低。
16 实时荧光定量PCR基础知识 如果同时进行靶点和标准品多重反应，则多重反应还具有另一个优点——使加样精度错误最小化。
同一孔的靶点和标准品数据来源于一次加样，因此任何加样精度错误应对靶点和标准品结果具有同等影响。
为获得精度优势，必须采用同一孔的标准品数据对靶点数据进行标准化，然后计算技术重复的精度。
比较利用单重反应方式分析的数据(未经过基于孔的标准化)与利用多重反应方式完成的分析，证明多重反应的精度优势较大，具体取决于单重反应的错误。
例如，对于单重反应精度错误极少的样本，多重反应的精度优势也微乎其微。
对于需要更高精度的定量实验，多重反应的精度优势显得尤为重要。
例如，在拷贝数变异实验中，区分1拷贝基因与2拷贝基因是2倍差异，需要良好的精度。
但区分2拷贝基因与3拷贝基因仅为1.5的差异，这需要更高的精度。
对于此类型的实验，推荐采用多重反应方法，其有助于达到该实验所需的精度。
多重反应仪器 多重反应分析通常需要在同一孔内加入多种染料。
实时荧光定量PCR仪必须能够准确地检测同一孔内的不同染料信号。
这些测量必须保持针对各染料的特异性，即便当一种染料信号明显高于其它信号时。
多重反应试剂推荐 实时荧光定量PCR多重反应的最佳荧光试剂是那些可以指定不同染料来检测多重反应中的各个基因序列的试剂。
绝大多数多重分析采用了多种染料、高特异性的试剂，如基于TaqMan®探针的Assay。
对于RNA多重反应分析，我们一般推荐两步法RT-PCR，而非一步法RT-PCR。
一步法RT-PCR要求逆转录和PCR的引物浓度相同，降低了多重反应引物浓度的灵活性。
而在两步法RT-PCR中，可对PCR引物浓度进行多重反应优化，且不会影响逆转录。
多重反应的染料选择 假定采用的是多染料实时荧光定量PCR荧光试剂，则多重反应中各种基因序列的检测将需要不同的报告基团染料。
同一孔内的报告基团染料必须被实时荧光定量PCR 仪充分激发并准确检测。
仪器生产商应能够提供推荐染料。
请注意，AppliedBiosystems®实时荧光定量PCR预混液中包含一种红色的参比荧光染料。
仅带有蓝色激发光的仪器可充分激发基于ROX™染料的参比荧光染料，但蓝色激发光一般不足以激发用作报告基团的红色染料。
无需根据靶基因或基因产物的类型指定报告基团染料，但遵循染料的指定模式可简化多重分析的构建。
例如，FAM™染料是TaqMan®探针中最常用的报告基团染料。
我们遵循其模式指定FAM™染料作为靶点分析的报告基团染料，并指定VIC®染料作为标准品分析的报告基团染料。
采用此模式，可通过将不同的FAM™染料标记的靶点分析与相同的标准品分析VIC®染料进行配对，构建多个双链分析。
进行三重分析时，可将第三种染料ABY®或JUN®染料与FAM™染料和VIC®染料相结合。
请注意，如使用ABY®染料，则在同一孔内不应有TAMRA™染料存在，如果使用JUN®染料，MUSTANGPURPLE®应该作为参考标准取代ROX™染料。
多重反应PCR饱和 多重反应PCR饱和是当丰度更高的基因扩增使热稳定性DNA聚合酶饱和时，多重分析中可能出现的不良现象，它抑制了较低丰度基因的扩增。
饱和的补救措施是减少丰度更高的靶点的PCR引物的浓度，称为“引物限制”。
引物限制的浓度应足够实现几何扩增，但需在PCR产物聚集到遏制较低丰度靶点扩增之前使引物耗竭。
计划多重分析时，研究人员应根据PCR反应中各基因和基因产物的DNA或cDNA绝对丰度，识别多重反应中哪种基因或哪些基因有可能引起饱和。
为此我们列出了三种最常见的双链情景。
双重反应情景
1 在这个最常见的情景中，所有样本中丰度更高的基因或基因产物均相同。
仅丰度更高的靶点分析需要引物限制。
例如，标准品可能是18S核糖体RNA，其占真核细胞总RNA的20%。
每个样本中18SrRNAcDNA的丰度高于任意mRNAcDNA。
因此仅18S分析需要引物限制。
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1 实时荧光定量PCR基础知识 双重反应情景
2 在本情景中，两个基因在所有样本中的丰度几乎相同。
一般而言，两种基因的Ct差异为3或者更高，假定阈值相同，则认为两个基因的丰度不同。
基因组DNA应用领域(如拷贝数差异)最可能出现此情景。
情景2无需引物限制，因为两种基因几乎同时经历几何扩增期。
双重反应情景
3 在本情景中，基因或基因产物的丰度明显高于其它。
此时，两种分析均应为引物限制。
多重反应引物相互作用 影响多重分析性能的另一个潜在威胁是不同分析的引物间不必要的相互作用。
引物相互作用的风险会随反应中分析数目的增加而提高，因为随着多重反应分析数的增加，出现的引物对的数目会随之大幅增加。
例如，在包含4个PCR引物的双重反应分析中，可能有6种不同的PCR引物对，在包含6个PCR引物的三重分析中，则可能有15种不同的PCR引物对。
在单重反应中，每个分析可能都运行得很好，但在多重反应中，引物的相互作用可形成竞争产物，抑制扩增的进行。
当多重反应分析具有同源性时，引物相互作用的几率会提高。
如果基于单重反应与多重反应的Ct值存在明显差异的观察得出存在引物的相互作用的现象，则补救措施是对之前的多重反应的实验采用不同的Assay进行。
1.10内部质控品和参考基因 实时荧光定量PCR已成为一种可选的基因表达分析方法。
要利用实时荧光定量PCR获得所选基因的准确且可重复的表达图谱分析，使用可靠的内部对照基因产品对不同实验的表达水平进行标准化至关重要——通常采用看家基因的表达产物。
被选为内部标准品(或内源性对照)的靶点的表达水平应与实验基因产物大致相当。
使用内源性对照作为主动参考，可在mRNA靶点定量时对每个反应中加入的总RNA量差异进行标准化。
无论选择哪个基因作为内源性对照，都必须在各种实验条件下对其进行测试，以确保对照基因在所有条件下均能稳定表达。
采用看家基因进行相对基因表达分析 当所选的看家基因的表达水平保持恒定时，可达到最佳的相对基因表达比较效果。
BioTechniques29:332(2000)和JMolEndocrinol25:169(2000)上的几篇文章论述了看家参考基因的选择。
理论上，所选的看家基因的表达水平应经过各种靶细胞或组织类型验证，以确认其在实验过程中保持恒定。
例如，在增殖细胞中GAPDH会出现表达上调，18S核糖体RNA(rRNA)无法代表全部细胞mRNA群。
18 实时荧光定量PCR基础知识 1.11实时荧光定量PCR仪校准 准确的校准是实时荧光定量PCR仪达到最佳性能的关键。
它可长时间保护数据的完整性和一致性。
实时荧光定量PCR仪应定期校准，在第一次使用新染料之前，亦须遵循生产商的说明进行校准。
激发/发射光差异校正 实时荧光定量PCR仪的光学元件可分为两大类：激发光源(如卤素灯或LED)和发射光检测器(如CCD或光电二极管)。
尽管生产商可在模块的各孔内实现极佳的激发光强度和发射光灵敏度一致性，但仍始终有些差异存在。
这种差异会随仪器年限和使用的增加而增加。
反应板内未校正的激发/发射光差异可引起Ct值改变。
但如果反应中存在参比荧光染料，则上述差异对报告基团和参比荧光信号的影响程度相同，因此报告基团的参比荧光标准化可校正其差异。
一般光学波动 在传统的塑料PCR反应板和管内，液体试剂处于孔底，空气在液体的上方，孔上采用了塑料密封。
该配置可出现多种与温度有关的现象。
在循环过程中，温度可达到95°
C。
在这么高的温度下，水可挥发至孔内的气体空间内。
该水蒸气或水流将在冷的管壁上冷凝，形成水滴后滴入底部的试剂中。
整个过程称为“回流”，在PCR过程中连续进行。
其次，在高温下，液体试剂内溶解的气体的溶解性下降，产生小气泡。
第
三，水流的压力将给塑料密封施加作用力，使PCR过程中密封形状出现轻微改变。
上述所有温度相关的现象都在激发和发射光的光径上，可引起荧光信号波动。
这些波动的程度各异，具体取决于多个因素，如试剂中溶解的空气量及反应板的密封程度。
一般波动通常不会使报告基团信号产生明显的失真，但它们可影响重复样本的精度。
如有波动存在，参比荧光染料与报告基团的光径相同，报告基团的参比荧光信号标准化可校正上述波动。
精度提升 参比荧光染料标准化的校正作用将提升实时荧光定量PCR数据的精度。
提升度各不相同，取决于各种因素，如试剂和反应板的制备方法。
异常光学波动 异常光学波动是所有运行反应中不普遍存在的热学相关的异常，可使报告基团信号产生明显失真。
异常光学波动的示例之一是反应板密封配置的重要变化，被称为“光学扭曲”。
当反应孔密封不当时可出现光学扭曲，随后，在PCR过程中，加热的盖子的热量和压力可使密封合适。
另一个示例是PCR过程中大气泡的破裂。
扩增曲线中的变形可能引起基线问题，甚至可影响Ct值。
参比荧光染料标准化提供了极佳的光学扭曲校正，可完全消除校正后的标准曲线中的异常。
标准化不能完全校正大气泡破裂，但有助于使数据失真最小化。
1 19 实验设计
2 实验设计 2.1引言 22 2.2实时荧光定量PCRAssay类型 22 2.3扩增片段和引物设计的考虑因素 23 2.4核酸纯化和定量 26 2.5逆转录的考虑因素2.6对照品 228 30 2.7标准化方法 30 2.8采用标准曲线评估效率、灵敏度和可重复性 32 21 实验设计 2.1引言 成功的实时荧光定量PCRAssay设计和开发是获取准确数据的基础。
前期规划将有助于管理在此过程中出现的实验差异。
在着手实验设计前，应清晰地了解Assay的目标，尤其是需要回答哪些生物学问题。
例如，旨在确定特定疾病状态下某个基因的相对表达水平的实验与旨在确定该疾病状态下病毒拷贝数的实验具有很大的差异。
在确定实验目标后，识别适当的实时荧光定量PCR对照和进行实验优化 的可能性。
本部分将介绍实时荧光定量PCRAssay设计和执行的各个阶段。
我们将从下面几个方面鉴别差异的来源、其在数据准确性方面的作用以及优化指导原则： •靶向扩增片段和引物设计•核酸纯化•逆转录•质控品和标准化•效率、灵敏度和可重复性标准曲线评估
2 2.2实时荧光定量PCRAssay类型 基因表达谱分析是实时荧光定量PCR的常见应用之
一，其通过评估转录本的相对丰度，确定不同样本的基因表达图谱。
RNA质量、逆转录效率、实时荧光定量PCR效率、定量方法及标准品基因的选择在基因表达实验中发挥了尤为重要的作用。
病毒滴度测定Assay的设计较为复杂。
研究人员通常想要定量样本中的病毒拷贝数。
一般采用已知基因组等效物或从已滴定的病毒对照品中采集的核酸生成标准曲线，通过与标准曲线进行比较实现滴度测定。
实验成功与否取决于生成标准曲线所用的材料的准确度。
根据靶点的性质——RNA或DNA病毒——逆转录和实时荧光定量PCR的效率亦具有重要的作用。
病毒是否为功能性病毒或该研究是否对总病毒颗粒进行分析，都将影响到Assay设计。
在拷贝数变异分析中，基因组进行重复或缺失分析。
Assay设计，特别是标准曲线的生成将取决于是要求相对还是绝对定量。
Assay设计主要关注区分单拷贝差异需要的实时荧光定量PCR效率和准确度。
最后，等位基因分型Assay可以检测低至单核苷酸水平的差异。
与上述方法不同，它需要检测终点荧光，确定SNP基因型。
引物和探针设计是确保等位基因特异的交叉反应性低发生率的关键。
22 实验设计 2.3扩增片段和引物设计的考虑因素 靶向扩增片段大小、GC含量、位置和特异性 反应效率对实时荧光定量PCR数据的准确度极为重要，本指南将在后面的部分对此进行更详细的介绍。
在理想状态下，每个循环后，PCR反应中的每个靶点拷贝将被复制，全长靶分子数目倍增：这对应100%扩增效率。
随着热循环过程的进行，效率的差异将被放大。
因此，100%效率的任何偏差均可导致潜在的错误数据。
使效率偏差最小化的一种方法是扩增相对较短的靶点。
在特定的循环中扩增100bp的区域相比扩增1,200bp的靶点，更有可能实现完整合成。
因此，实时荧光定量PCR靶点的长度一般为60–200bp。
此外，较短的扩增片段受靶点-模板完整性差异的影响更小。
如果核酸样本出现轻微降解，而靶序列较长，则上游和下游引物在同样的DNA片段中寻找其互补序列的难度将更大。
扩增片段的GC含量和二级结构是引起数据不准确的另一个因素。
如果二级结构阻碍了DNA聚合酶的路径，则每次循环更有可能出现不完美的靶点扩增。
理论上，设计的引物应可与中等(50%)GC含量且无明显GC延伸段的区域退火结合并扩增。
对于cDNA扩增，最好使扩增片段位于转录本的3’端附近。
如果RNA二级结构阻止了某些转录本的全长cDNA合成，则这些扩增片段受影响的可能性更小(图14)。
靶点特异性是影响数据准确度的另一个重要因素。
设计实时荧光定量PCR引物时，应检查引物以确保其结合位点是基因组中独一无二的。
这降低了引物扩增样本基因组中的其它类似序列的几率。
引物设计软件程序自动去除位于起始基因组和掩蔽同源区域的靶序列，避免了这些位点的引物设计。
基因组DNA、假基因和等位基因变异体 在检测基因表达水平时，需要关注RNA样本中的基因组DNA残留。
gDNA可与目的靶点转录本共扩增，从而产生无效数据。
通过设置不含有逆转录酶的对照反应(RT质控品)检测基因组DNA污染；如果RT质控品的Ct值高于稀释度最高的靶点生成的Ct值，则表示无gDNA信号生成。
但由于gDNA可竞争反应组分(如dNTP和引物)，因此会影响反应的效率。
实时荧光定量PCR中避免gDNA干扰的最佳方法是利用gDNA中存在而mRNA中不存在的内含子，进行周到的引物(或引物/探针)设计。
设计TaqMan®GeneExpressionAssay时应尽可能使TaqMan®探针覆盖相邻两个外显子交界处。
设计用于基于SYBR®Green染料检测的引物组时，应使引物与相邻外显子序列退火结合，或者使其中一个引物覆盖相邻两个外显子交界处。
当上游和下游PCR引物与同一个外显子退火结合时，则它们既可以扩增DNA靶点，也可以扩增RNA靶点。
相反，当引物与相邻外显子序列退火结合时，大多数情况下仅可以扩增cDNA，这是由于gDNA扩增片段包括内含子序列，从而导致扩增片段过长，无法在实时荧光定量PCR条件下实现高效扩增。
假基因或沉默基因是设计引物时也需要考虑的转录本变异体。
它们是现有基因的衍生物，由于启动子或基因本身的突变和/或重排导致了功能丧失。
引物设计软件程序可进行BLAST搜索，避免出现假基因及其mRNA产物。
等位基因变异体是一个基因的两种或多种独特的形式，它们具有相同的染色体位点。
源自上述变异体的转录本相差一个或多个突变。
设计引物时应考虑等位基因变异体，具 图14.具有高度二级结构的RNA分子。
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2 实验设计 体取决于研究的是一个还是多个变异体。
此外，变异体之间的GC含量差异可改变扩增效率，并在熔解曲线上生成单独的峰，易被错误地诊断为脱靶扩增。
设计引物时还应考虑可变剪接的变异体。
引物和探针的特异性、二聚体形成和自折叠 引物二聚体形成的最常见原因是正向和反向引物的相互作用，但也可能是由于正向引物与正向引物或反向引物与反向引物之间的退火或者单个引物自身的折叠引起的。
在更复杂的反应(如多重实时荧光定量PCR)中，引物二聚体更值得关注。
如果以交错排列的方式形成二聚体(通常是这种情况)，则可出现一定的延伸，形成大小接近目的扩增片段的产物，且丰度随着循环的进行而增高。
一般而言，PCR反应的起始靶点量越少，形成引物二聚体的可能性越大。
上述潜在问题的积极方面在于，引物二聚体之间的相互作用弱于目的引物与模板之间的相互作用，此外，有很多方法可以最大程度地减少或消除此现象。
引物二聚体的主要问题在于它们可引起假阳性结果，特别是使用DNA结合染料(如SYBR®GreenI染料)的反应。
另一个问题是它会导致与反应组分的竞争作用，使反应效率超出90-110%的理想范围。
最后一个主要问题也与效率有关，是反应的动态范围可能缩小，从而影响反应的灵敏度。
即便信号并非来自引物二聚体本身(如TaqMan®Assay)，反应的效率和动态范围仍将受到影响。
有几款免费的软件程序可分析您的实时荧光定量PCR引物设计，并确定它们是否容易形成二聚体或自折叠。
AutoDimer程序(由美国国家标准与技术研究院的
P.M.Vallone编制)是一款可同时分析各种引物的生物信息学工具(图15)。
这尤其适用于多重反应领域。
但虽然引物序列的生物信息学分析会大大降低二聚体形成的风险，但仍需要通过实验对二聚体形成进行监测。
传统的引物二聚体筛查方法是凝胶电泳，二聚体会在凝胶的底部形成扩散的模糊条带(图16)。
凝胶验证的问题之一是它的灵敏度不高，因此可能无法得出结果。
但凝胶分析 图15.AutoDimer软件屏幕截图。
该软件可用于分析引物序列并报告引物内可能的二级结构区域(可导致引物自折叠)或可使引物相互退火结合的延伸段序列。
图16.通过琼脂糖凝胶分析研究引物二聚体的形成。
在热循环反应前，将核酸样本连续梯度稀释后加入PCR混合物中，然后从每种混合物中取相同体积上样，进行琼脂糖凝胶电泳。
引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带。
适用于验证从熔解/解离曲线获取的数据，这是检测引物二聚体的最佳方法。
采用DNA结合染料进行检测的实时荧光定量PCR运行结束后，应生成熔解或解离曲线。
简言之，仪器从低温状态开始升温，低温下DNA呈双链且荧光强度较高，达到高 24 实验设计 温时，DNA开始变性，荧光强度开始下降。
在PCR过程中生成的各产物的Tm值处将观察到荧光出现明显下降。
比较无模板对照(NTC)的熔解曲线峰与靶点峰，确定反应中是否存在引物二聚体。
理论上，包含模板的每个反应应观察到一个单峰，而NTC中应无荧光峰存在。
在较低熔解温度下出现的比目的扩增片段更小、更宽的峰，且同时出现在NTC反应中的，通常是二聚体。
同样，产物凝胶电泳常可用于验证熔解峰对应的产物的大小。
有些情况下，引物二聚体存在并不会影响实时荧光定量PCR分析的总体准确度。
一个常见的现象是引物二聚体存在于无模板对照中，但在包含模板DNA的反应中没有。
这并不奇怪，因为在模板不存在时，引物更有可能相互作用。
当有模板存在时，不利于引物二聚体形成。
只要在NTC中观察到的峰未出现在模板解离曲线上，引物二聚体就没有问题。
引物二聚体是一大类非特异性PCR产物中的一部分，包括当引物与不理想位点不完美匹配后退火结合形成的扩增片段。
非特异性产物扩增值得关注是因为它们可发出荧光，人为地改变反应的Ct值。
它们可以通过竞争反应组分影响反应效率，降低动态范围和数据准确度。
在绝对定量分析中，需要报告精确的拷贝数，因此非特异性产物更值得关注。
标准凝胶电泳通常是实时荧光定量PCR特异性分析的第一步。
它可以鉴别与您的靶点扩增片段大小不同的产物，但其条带会掩盖大小相似的扩增片段，且灵敏度有限。
鉴 于熔解曲线分析的准确度和灵敏度，它是确认凝胶电泳引物特异性评估的最值得信赖的方法。
尽管非特异性扩增应始终尽量避免，但在某些情况下，这些二级产物的存在并不会引起严重的问题。
例如，如果以GC含量不同的异构体或多个等位基因为靶点，则预计会出现多个产物。
引物设计的考虑因素 设计实时荧光定量PCR引物时有下列推荐：PrimerExpress®，OligoPerfect™Designer和VectorNTI®软件。
请注意，引物设计软件程序，如我们的在线OligoPerfect™设计程序和VectorNTI®软件序列分析软件，可与我们的在线订购系统无缝连接，因此您无需复制粘贴序列。
这些程序可自动设计针对特定基因或靶序列的引物，其算法采用了下列指导原则，此外还可以进行已知序列同源物的全基因组BLAST搜索。
•设计引物的长度一般为18–28个核苷酸•避免重复核苷酸延伸段•目标为50%GC含量，有助于防止错配稳定化•选择Tm值匹配的引物(在5°C范围内)•避免一个分析中采用的所有引物之间以及各引物内部 出现序列互补
2 25
2 实验设计 2.4核酸纯化和定量 实时荧光定量PCR核酸纯化方法 在进行核酸纯化之前，必须考虑原材料(细胞或组织)及可能的技术限制。
DNA和RNA提取技术在易用性、是否需要有机溶剂及因残余DNA(在RNA提取中)、蛋白质和有机溶剂导致的核酸纯度方面差异较大。
本部分将重点讨论RNA提取，但其中大部分指导原则亦适用于DNA提取。
一步法有机试剂萃取是一种极为有效的从各种细胞和组织类型中纯化RNA的方法。
许多实验方案采用酚和异硫氰酸胍混合物破坏细胞，溶解细胞组分，同时保护核酸不被RNA酶降解，维持核酸的完整性。
异硫氰酸胍是一种高离液盐，可防止RNA被内源性的RNA酶降解(Biochemistry18:5294(1979))。
一般随后加入氯仿，通过离心将混合物分为水相和有机相。
在异硫氰酸胍存在的情况下，RNA只保留在水相中，而DNA和蛋白质存在于有机相和相界面中。
然后采用异丙醇沉淀，从水相中提取出RNA。
此过程相对较快，可以获得高水平的RNA，但需要使用有毒的化学试剂，且DNA残留量较采用其它技术更高。
残留的胍、酚或乙醇还会大大降低cDNA合成的效率。
大多数基于硅胶磁珠或过滤器的方法是在存在异硫氰酸胍的溶液中裂解样本并匀浆化。
匀浆化后，在样本中加入乙醇，RNA与硅胶磁珠或过滤器结合，通过冲洗有效去除杂质，ProcNatlAcadSciUSA76:615(1979)。
用水洗脱纯化的总RNA。
与有机萃取法相比，该方法更省时，且无需使用酚。
RNA产量不高，但纯度(蛋白质、多糖、DNA和纯化试剂)更好。
仍会出现因冲洗不充分导致的胍和乙醇残留，且同样会对cDNA合成的效率产生负面影响。
最后，将有机裂解与硅胶柱相结合的方法可提供良好的样本裂解，以及硅胶结合法所具有的简便、速度和纯度优势。
评估RNA的品质 在评估RNA品质和数量时，应注意几个关键点。
确保A260/A280比值在1.8和2.0之间。
比值低于1.8表示存在蛋白质污染，会降低反应效率。
A260/A280比值有助于评估包含苯环的组分的残留，如离液盐异硫氰酸胍和酚，它们会抑制酶反应。
在变性凝胶或诸如AgilentBioanalyzer等仪器上评估RNA的完整性(图17)。
图17.AgilentBioanalyzer示踪和凝胶成像显示RNA的完整性。
完整的哺乳动物总RNA显示了两个条带或峰，分别代表18S和28SrRNA。
一般而言，28SrRNA的亮度(或Bioanalyzer示踪中峰的面积)是18SrRNA的两倍。
AgilentBioanalyzer®系统只需一步即可测定RNA品质，并分配RIN(RNA完整值)值。
利用全部示踪(包括降解产物)计算RIN值，其效果优于仅评估rRNA峰。
研究人员随后可以比较不同组织类型RNA的RIN值，评估质量标准化和一致性维护。
26 实验设计 定量准确度 在RNA定量领域，荧光染料(如RiboGreen®和PicoGreen®染料)具有更高的灵敏度、准确度和高通量性能，效果优于紫外吸光度测量法。
紫外吸光度测量无法区分核酸和游离核苷酸。
事实上，游离核苷酸在260nm的吸光度高于核酸。
紫外吸光度测量同样无法区分同一样本中的RNA和DNA。
此外，纯化核酸样本中常见的污染物会影响紫外吸光度读数。
最后，大多数紫外吸收光酶标仪在测量过程中需要消耗大量的样本。
可供选择的荧光染料种类很多，我们可以找出能克服上述所有限制的试剂：能够区分核酸和游离核苷酸的染料，能够区分同一样本中的RNA和DNA的染料，以及对常见样本污染物不敏感的染料。
Qubit®定量平台利用Quant-iT™荧光技术，采用先进的荧光基团，一旦与DNA、RNA或蛋白质结合即可发出荧光。
该特异性意味着您可以获得比紫外吸光读数更准确的结果，因为Quant-iT™分析试剂盒只报告靶分子的浓度(而非污染物)。
一般而言，采用荧光染料的定量方法极为灵敏且只需少量样本。
表达研究中的基因组DNA残留 我们在前面介绍了引物设计是避免实时荧光定量RT-PCR反应中的DNA扩增的第一步。
在RNA提取阶段采用DNA酶处理样本，可从源头控制DNA。
除传统的DNA酶I外，LifeTechnologies还可提供超高活性的TURBO™DNA酶，其催化活性优于野生型DNA酶
I。
它甚至可以去除少量的DNA，避免其影响RT-PCR。
DNA酶处理可以在溶液或分离柱内完成，具体取决于分离方法。
柱上DNA酶处理常用于硅胶基质萃取，与溶液内处理不同，它在EDTA存在的条件下无需热灭活，因为盐本身可以去除酶。
其缺点在于柱上反应需要更多的酶。
溶液内DNA酶反应通常需要在65°C下对DNA酶进行热灭活。
反应所需的游离镁在此温度下可引起镁依赖的RNA水解。
DNA-free™和TURBODNA-free™试剂盒采用了新型DNA酶灭活试剂，有助于避免上述问题。
灭活试剂不仅可以去除反应中的DNA酶，还可以结合并去除反应缓冲液中的二价阳离子。
这还减少了将二价阳离子引入RT-PCR反应的问题，二价阳离子会影响反应的效率。
2 27
2 实验设计 2.5逆转录的考虑因素 逆转录酶 qRT-PCR中使用的大多数逆转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)。
天然AMV逆转录酶的热稳定性一般优于M-MLV，但产量较低。
但是，对这些天然的酶进行适当的处理，可生成适用于qRT-PCR的变异体。
理想的逆转录酶具有下列特性： •热稳定性——如前所述，二级结构对反应灵敏度的影响较大。
天然RT在理想工作温度为42°C至50°
C，而热稳定性RT在该温度范围的上限(或者更高)方可发挥作用，实现GC富集区域的逆转录 •降低的RNA酶H活性——常见的天然逆转录酶中存在RNA酶H结构域，它在体内可剪切RNA-DNA杂交双链的RNA链，供复制的下一阶段使用。
在qRT-PCR应用领域，RNA酶H活性可大幅降低全长cDNA的产量和比例，从而降低了反应的灵敏度。
现推出的几种RT(尤其是SuperScript®II和III)具有较低的RNA酶H活性。
一步法和两步法qRT-PCR 可从便捷性、灵敏度和Assay设计几个方面选择一步法和两步法qRT-PCR。
必须根据各个实验评估各种技术的优点和缺点。
在一步法反应中，逆转录过程中同时存在逆转录酶和热稳定性DNA聚合酶，RT在高温DNA聚合酶活化阶段被灭活(所谓的热启动)。
正常情况下，适合RT的缓冲液不适用于DNA聚合酶。
因此，一步法缓冲液是一种折中的溶液，为两种酶提供了可以接受但并非最佳的功能。
虽然其功能性稍差，但采用这种单管操作，在PCR阶段可以对生成的所有cDNA进行扩增。
一步法qRT-PCR的优点包括： •防止污染——闭管系统可防止在RT和PCR阶段引入污染物 •便捷——移液步骤减少，最大程度缩短操作时间•高通量样本筛选——理由如上•灵敏度——由于生成的所有第一链cDNA均被用于实 时荧光定量PCR扩增，因此一步法反应的灵敏度高于两步法反应 一步法qRT-PCR的缺点包括： •形成引物二聚体的风险更高——一步法反应中存在的正向和反向基因特异性引物，极易在42–50°C逆转录条件下形成二聚体。
对于采用DNA结合染料进行检测的反应，这个问题尤为严重 •cDNA不适用于其它实时荧光定量PCR反应——一步法反应采用了RT步骤的所有cDNA，因此如果反应失败，则样本丢失 在两步法qRT-PCR中，逆转录的缓冲液已针对逆转录酶进行优化。
逆转录完成后，约10%的cDNA被转移至各个实时荧光定量PCR反应中，且采用了最佳的缓冲液。
两步法qRT-PCR的优点包括： •cDNA可以保存并用于其它实时荧光定量PCR反应——两步法qRT-PCR生成了足量的cDNA，可用于多个实时荧光定量PCR反应，适用于珍贵或有限的样本 •灵敏度——由于两步法反应的RT和实时荧光定量PCR反应分别采用了优化的缓冲液，因此其灵敏度优于一步法 •多靶点——根据使用的RT引物，您可以从单个RNA样本中筛查多个靶点 两步法qRT-PCR的缺点包括： •RT酶和缓冲液可抑制实时荧光定量PCR——由于RT及相关的缓冲液如果稀释不当，可抑制DNA聚合酶，因此一般仅10%的cDNA合成反应被用于实时荧光定量PCR。
特定的抑制水平取决于RT、靶点的相对丰度和扩增反应的可靠性。
•便捷性较差——两步法反应需要更多操作，不适用于高通量应用 •污染风险——由于每步使用单独的试管，因此增加了污染的风险 28 实验设计 RNA引物设计策略 逆转录是qRT-PCR反应中最可变的部分。
第一链合成反应可使用基因型、oligo(dT)或随机引物(图18)，引物选择对于RT效率和一致性的影响较大，进而影响数据的准确度。
随机引物可用于生成大量的cDNA，因此可提供最高的实时荧光定量PCR灵敏度。
它们还适用于非多聚腺苷酸化RNA，如细菌RNA。
由于它们可与整个靶分子退火结合，因此降解的转录本和二级结构不会引起与基因特异性引物和oligo(dT)引物同样严重的问题。
尽管产量提高是随机引物的一个优点，但数据显示它会高估拷贝数。
采用随机和oligo(dT)引物的结合物可结合它们在RT反应中的优点，提高数据质量。
随机引物仅适用于两步法qRT-PCR反应。
Oligo(dT)引物具有mRNA特异性，且当其用于引物反应时，可对同一cDNA库的许多不同靶点进行分析，因此是两步法反应的理想选择。
但是，由于它们始终从转录本的3’端开始逆转录，复杂的二级结构可导致不完整cDNA的生成。
片段化RNA的oligo(dT)引发，如从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本中分离的RNA也有问题。
不过，只要实时荧光定量PCR引物的设计靠近靶点的3’端，在此位点下游提前终止将不会引起严重的问题。
有多种类型的oligo(dT)可供选择。
Oligo(dT)20是20-mer胸苷的均匀混合物，oligo(dT)12-18是12-mer至18-mer胸苷的混合物。
锚定oligo(dT)引物在3’UTR/poly(A)交界处退火结合，可避免poly(A)滑移。
最佳oligo(dT)的选择在一定程度上取决于反应温度。
热稳定性更高的RT采用较长引物的反应效果更佳，与较短的引物相比，它们在高温下可维持更紧密的退火结合。
如果18SrRNA用于标准化，则不推荐oligo(dT)引物。
序列特异性引物可提供最高的特异性，是最稳定的RT引物方案。
但它们不具备oligo(dT)和随机引物的灵活性，仅能生成1个cDNA拷贝的靶基因产物。
正因如此，基因特异性引物一般不是稀有或珍贵样本研究的最佳选择。
一步法qRT-PCR反应均采用基因特异性引物进行第一链合成，其它引物方案适用于两步法反应。
每种引物类型理论上都具有独特的优点和缺点。
此外，单个靶点对不同引物的反应各异。
理论上，应在初始Assay验证阶段对各种引物选项进行评估，以确定哪种引物可提供最佳的灵敏度和准确度。
影响逆转录效率的因素 qRT-PCR反应的RT阶段的稳定性低于PCR阶段。
这是与起始样本有关的多种因素造成的，一般未经过热稳定性DNA聚合酶测试。
这些因素包括： RNA完整性差异：特定RNA样本的降解程度直接影响了转换为cDNA后定量的mRNA靶点的百分比。
根据使用的第一链引物的不同，降解阻止了RT形成可与全长靶点扩增片段反应的cDNA。
RT效率越低，PCR分析的灵敏度越低。
未经过标准化的效率差异可导致不准确的结论。
2 图18.常用的RNA引发策略图示。
29
2 实验设计 GC含量、RNA样本复杂性和采用的RT酶：如果RT对样本之间不可避免的差异的敏感度较低，则RNA表达水平比较更准确。
例如，数据显示所有背景核酸与RT引物不相容，可使反应效率产生高达10倍的差异。
最好使用能在此背景下实现稳定的cDNA合成的RT。
有机溶剂和离液盐残留：乙醇和胍是RNA捕获所必需的，但会抑制酶反应。
RNA样本间上述污染物的含量差异可影响样本的比较。
因此，使用上述副产物含量相对较低的RNA提取方法至关重要。
我们还建议在实时荧光定量PCR反应中使用验证的标准品基因。
2.6对照品 实时荧光定量PCR反应的对照品可证明从实验样本中获取的信号可表示目的扩增片段，从而验证了反应的特异性。
所有实验应包括无模板对照(NTC)，qRT-PCR反应还应包括无逆转录酶(no-RT对照)。
NTC对照品应包含除DNA或cDNA样本外的所有反应组分。
这些孔内检测到的扩增是由于引物二聚体或PCR反 应产物的污染。
这种污染类型可使测得的表达水平高于实际值。
No-RT反应应包含除逆转录酶外的所有反应组分。
如果在no-RT对照品反应中可观察到扩增产物，则表示DNA而非cDNA被扩增。
这也可以人为夸大实验样本的表达水平。
2.7标准化方法 在本指南的开头，我们指出消除实验不一致性对于实时荧光定量PCR实验设计极为重要。
偏离实验计划会限制研究人员比较数据的能力，如果在分析时未考虑此偏离，则可导致错误的结论。
实验差异的来源包括起始样本的性质和数量、RNA提取过程、逆转录以及实时荧光定量PCR扩增。
标准化是中和上述差异效应的重要过程。
在实时荧光定量PCR的每个阶段都有单独的标准化策略，但其中一些策略更为有效。
这包括： 样本量标准化：利用相同量的样本(如组织或细胞)进行RNA或DNA提取可使差异最小化，但这只是近似值，且无法解决RNA提取中的偏差。
RNA或DNA量标准化：必须对RNA或DNA样本进行精确的定量和质量评估，但只采用该方法进行标准化仍存在不足，因为其无法控制逆转录和实时荧光定量PCR的效 率差异。
例如，污染物水平的微小差异会影响RT反应并降低扩增效率。
在PCR过程中样本的差异会被扩增，可能出现与样本的生物状况无关的巨大倍数变化。
移液也容易出现操作差异，且无法利用纯化后RNA分析的标准化来补偿。
参考基因标准化：使用标准品基因(又称为参考基因或内源性对照)是解决实时荧光定量PCR中几乎所有来源的差异最彻底的方法。
但采用此方法时，所有样本中的该基因必须表达一致。
有效的标准品基因可对照RNA的质量和数量，以及逆转录和实时荧光定量PCR扩增效率的差异。
如果两个不同的样本中逆转录或者DNA聚合酶扩增靶点的效率不同，则标准品转录本将反映出该差异。
可使用内源性参考基因，如看家基因或外源性核酸靶点。
30 实验设计 内源性对照 实时荧光定量PCR中的常见内源性标准品包括： •β-actin(ACTB)：细胞骨架基因•18S核糖体RNA(rRNA)：核糖体亚单位•亲环素A(PPIA)：丝氨酸苏氨酸磷酸酶抑制剂•3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：糖酵解途径•β-2-微球蛋白(B2M)：主要组织相容性复合体•β-葡萄糖苷酸酶(GUSB)：溶酶体内的外切糖苷酶•次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)：嘌呤补救合成 途径•TATA框结合蛋白(TBP)：RNA转录 由于每个实时荧光定量PCR实验各不相同，仔细周详的计划应包括选择标准品。
标准品的选择不是根据实验室中其他人的使用情况，而是应选择最符合特定靶点的定量策略的标准品。
质量标准品的第一个要求是其丰度与您的靶基因产物相当。
这对于多重反应尤为重要，因为如果在达到靶点Ct之前先达到标准品反应平台，标准品将阻碍靶点扩增，导致靶点Ct升高，从而影响反应的进行。
标准品反应还可采用引物限制条件，模拟较低的表达水平。
大多数TaqMan®内源性对照Assay可提供引物限制配方。
标准品靶点的实时荧光定量PCR分析的扩增效率应与实验靶点分析相当；可采用标准曲线进行评估。
尽管在比较不同效率的反应时可采用校正因子，但当反应效率相当时，准确度更高。
最后也是最重要的一点，无论样本的治疗或疾病状态如何，标准品的表达应保持稳定。
这必须通过实验测定，如图19所示。
应进行多次重复确保准确度，但无疑亲环素(PPIA)、TBP和HPRT1并不适用于这些治疗组，因其经过治疗后可出现表达下调。
即便是最常用的参考基因，在特定的条件下其表达水平亦有可能改变，因此应始终对其进行验证： 图19.常用内源性对照的基因表达水平及标准化的重要性。
在本例中，分析两个治疗组和一个正常组的常用参考基因表达水平，一同扩增的还有内部阳性对照(IPC)。
IPC提供了正常反应间差异的标准。
条形代表各治疗组与正常样本相比，标准品的上调和下调，正常样本的ΔCt为
0。
其目标是找到一种模拟IPC变化的标准品。
•GAPDH是一种常用的标准品，其在多数情况下表达稳定。
但是，GAPDH在某些癌症细胞、采用抑癌基因处理的细胞、缺氧状态及锰或胰岛素处理的样本中表达上调。
•β-actin是另一种常用的看家基因，其在大多数细胞类型中适中表达。
但其在乳腺上皮细胞、囊胚細胞、猪组织和牛心肌等中的表达稳定性尚有疑问。
•18SrRNA占细胞总RNA的85–90%，且其在大鼠肝脏、人皮肤成纤维细胞及人和小鼠恶性细胞组织中表达稳定。
但其丰度水平不适用于中等和低表达的靶点。
寻找适当的RNA浓度，使18SrRNA提供足够宽的基线，且在40个循环内生成目的靶点Ct，这通常较为困难。
此外，多重反应必须限制18S引物的浓度，以防标准品将所有反应组分隔离，使PCR条件不利于目的靶点的扩增。
2 31
2 实验设计 其它方法不取决于单个参考基因的准确度，而是多个验证标准品的几何平均数。
使用多个一致的标准品可更好地缓冲单个基因的Ct波动，从而提高分析和样本类型的灵活性。
外源性标准品 外源性标准品并不常用，但如果无法找到针对特定样本组的高度一致的内源性标准品，则外源性标准品是一种可行的选择。
外源性参考基因是合成或体外转录的RNA，其序列在实验样本中并不存在。
鉴于其外源性，它不会在不同状态或治疗的细胞中出现正常的生物学波动。
当使用外源性标准品时，其加入实验流程越早，则可以对照的步骤越多。
例如，如果将外源性转录本加入细胞裂解缓冲液中，则它可用作细胞裂解、RNA纯化及后续RT和PCR反应的标准品。
例如，外源性标准品有植物特异性的体外转录RNA，如光合作用基因。
由于哺乳动物没有同样的内源性转录本，因此可将它插入哺乳动物样本内。
采用外源性标准品的缺点有： •它不是内源性的。
在工作流程的早期插入外源性标准品(例如加入细胞裂解缓冲液中)，可使其用途最大化。
•当引入标准品时，准确度会受到加样差异的影响。
•长期储存和多次冻融可影响转录稳定性。
因此，应定 期进行拷贝数评估，确保其不会随时间变化而改变。
2.8采用标准曲线评估效率、灵敏度和可重复性 实验设计的最后一个阶段是验证前述参数可实现高效、灵敏且可重复的实验。
反应效率 如前所述，实时荧光定量PCR反应的整体效率取决于RT反应和PCR扩增反应的效率。
RT的效率取决于转换为cDNA的靶RNA百分比。
低转换率可影响灵敏度，但样本间转换百分比差异的影响更大。
PCR扩增效率是实时荧光定量PCR反应中最稳定的因素。
但是，该扩增可指数放大RT效率的轻微差异，可能会导致错误数据的出现。
100%效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增，但可接受的分析验证范围为90-110%。
该效率范围对应的标准曲线斜率为-3.6至-3.1。
图20的图表显示了仅由反应效率差异导致的测量偏差。
验证所有待比较的靶点(如参考基因和目的基因)的反应效率，优化其效率使之尽可能一致，并在数据分析过程中采用效率校正可减少上述效应。
这些测量将在后面的数据分析部分进一步讨论。
反应效率的最佳评估方法是生成标准曲线。
通过构建连续稀释的样本核酸，并进行实时荧光定量PCR，生成标准曲线。
然后以起始核酸量为X轴，以Ct为Y轴，绘制结果曲线。
用于生成标准曲线的样本(尽可能接近)应与将用于实验的样本匹配(即相同的总RNA或DNA样本)。
标准曲线分析的稀释范围或动态范围应涵盖实验样本预期的浓度范围。
曲线的斜率可用于测定反应效率，大多数科学家认为反应效率应在90%至110%之间。
32 实验设计 图20.不同的扩增效率引起的偏差效应。
四种不同的实时荧光定量PCR反应的效率在70%至100%之间。
其差异在早期循环并不明显。
但在30个循环之后，效率为70%的反应与效率为100%的反应之间报告的拷贝数差异达100倍。
反应的循环数越多，分析要求的灵敏度越高，效率差异就显得越重要。
图21.利用标准曲线评估实时荧光定量PCR反应的示例。
2 在图21中，生成了三种不同靶点的标准曲线。
红色和蓝色曲线平行表示它们的效率相当，因此可在任意稀释度实现准确比较。
此类型的比较示例是将标准品基因与靶基因进行比较，调整样本间的非生物学差异。
但紫色曲线在较低浓度下的效率也较低，因此无法在低浓度下实现准确比较。
除评估实验状态并为相对定量提供效率值外，标准曲线还可用于确定特定的反应问题是由于抑制还是缺少优化造成的。
在手册的疑难解析部分将对此问题进行更详细的讨论。
灵敏度和可重复性 效率在90–110%的理想窗口内的标准曲线确定了实时荧光定量PCR反应可测量的起始模板量范围。
某种程度上可通过靶点Ct在扩增曲线上出现的时间测定灵敏度。
但是，分析灵敏度的实际测量方法是特定少量的模板是否适用于标准曲线并维持理想的扩增效率。
符合要求的稀释度最高的样本决定了反应灵敏度。
标准曲线还包括R2值，用于测量重复样本的可重复性。
重复标准曲线以评估一致性，从而保持样本的数据准确度。
33 反应板制备
3 3.1混合3.2反应板装载3.3反应板密封3.4反应板插入 反应板制备 36363637
3 35 反应板制备 3.1混合 最好在短暂混合、离心所有实时荧光定量PCR反应组分后配制反应。
轻轻晃动含酶的预混液，短暂(1–2秒)涡旋其它组分(如PCR引物对或TaqMan®Assay)，解冻核酸样本。
由于实时荧光定量PCR预混液的密度高于其它实时荧光定量PCR反应组分，因此充分混匀反应混合物至关重要，否则将影响反应精度。
将试管轻轻上下颠倒几次，或者稍微涡旋1–2秒是高效的混匀方法。
但应避免过度涡旋，因其可形成气泡，影响荧光检测，并降低酶的活性，从而降低扩增效率。
应始终进行短暂离心，收集容器底部的内容物，并去除溶液的气泡。
3.2反应板装载 根据实验的性质确定试剂加入反应板或管的次序。
例如，如果您分析20种不同RNA样本中的5个基因的表达，则最好先将Assay混合物分至反应板或管内，然后加入样本。
另一方面，如果您只分析5种不同RNA样本中的20个基因的表达，则更简单的做法是先分配RNA样本，然 后加入Assay预混液。
无论加入试剂的次序如何，都应对移液进行规划，以免样本和Assay之间的交叉污染。
由于核酸具有亲水性且可迅速溶于Assay预混液，因此无需充分混匀反应组分。
3 3.3反应板密封 塑料PCR反应板可采用光学盖或光学覆膜密封，它们是一侧有粘性的薄塑料纸。
白色衬垫可保护其粘性。
覆膜的末端为带有穿孔的矩形凸起。
使用这些凸起操作覆膜，避免与其接触。
撕下白色衬垫，将覆膜置于反应板上方，边缘向内折起。
覆膜附带一个正方形的塑料安装工具。
用它弄平覆膜，特别是反应板上方的4个边缘。
还可在撕下白色条带时利用安装工具的边缘按住覆膜的各端，防止拉起覆膜。
检查反应板的上方，确认覆膜与反应板接触良好，特别是4个边缘。
密封好反应板后，拿起检查底部，看是否存在异常，如意外的空孔、液滴粘在孔壁上以及孔底存在气泡。
请注意空孔或体积异常的孔。
短暂离心反应板，解决粘附的液体和底部气泡问题。
应标记反应板裙边，或者提供条形码。
切勿写在反应板表面、孔的上方，这会影响荧光激发和读数。
也不要写在反应板底部，因为墨水会附在实时荧光定量PCR仪的模块上。
模块被彩色或荧光物质严重污染会影响实时荧光定量PCR数据。
36 反应板制备 3.4反应板插入 反应板准备好后，需遵循生产商的说明将其装载至实时荧光定量PCR仪中。
含有DNA或cDNA模板和AmpliTaqGold®试剂的反应板在室温下极其稳定。
它们可在正常的实验室光线条件下室温储存。
避免装载的反应板受到阳光直射；这会对混合物中的荧光染料造成影响。
如果您需要将反应板运送至室外，可用铝箔包裹反应板，以免阳光直射。
对于带有可更换的热循环模块的仪器，应确保安装与反应板类型相匹配的模块。
请注意96孔标准模块和96孔快 速模板不一样。
标准96孔反应板和标准管的容量为0.2mL，而快速96孔反应板和快速反应管的容量仅为0.1mL。
即便未使用快速模式，快速塑料产品也必须采用快速模块。
装载过程因仪器型号而异。
一些仪器带有抽屉式系统：拉出抽屉，将反应板置于模块或固定装置上，然后推回抽屉。
在某些仪器中，反应板位于仪器臂上，由计算机控制。
3 37 数据分析
4 4.1引言4.2绝对定量4.3相对定量4.4高分辨率熔解曲线(HRM)分析4.5多重实时荧光定量PCR分析 数据分析 4040424446
4 39 数据分析 4.1引言 如实验设计的开始部分所述，定量方法的选择取决于实验的目标。
•绝对定量可测定靶点的实际拷贝数，但也是最费力、最复杂的定量形式。
此方法要求周密的计划和高度准确的标准曲线。
绝对定量常用于确定病毒滴度。
•相对定量也需要仔细规划，但生成的数据是相对丰度，而非确切的拷贝数。
这是适用于基因表达研究的方法，可提供两种主要的定量方案：ΔΔCt和标准曲线定量。
4 4.2绝对定量 绝对定量是适合需要测定靶点实际拷贝数的研究人员采用的实时荧光定量PCR分析方法。
要进行绝对定量，需对已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧光定量PCR扩增，利用获得的数据生成标准曲线，标准曲线以各靶点浓度及相应的Ct值绘制。
然后将未知样本的Ct值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。
标准曲线生成——概述 采用绝对标准曲线，目的靶点的拷贝数必须已知。
这表示在生成曲线前，应准确定量模板。
图22重点显示了标准曲线设置。
目的靶点样本被准确测定为含有2x1011个拷贝。
将样本连续八次稀释10倍至2x103个拷贝，对每个稀释样本进行实时荧光定量PCR，重复至少三次。
生成的标准曲线与每个特定的Ct的拷贝数相关。
然后通过与该标准曲线进行比较，推算出未知样本的拷贝数。
定量的准确度与标准曲线的质量直接相关。
在绝对定量时，应考虑： 图22.绝对定量标准曲线设置流程。
1.用于生成标准曲线的模板及定量该模板采用的方法是实验的基础。
连续稀释时的加样准确度极为重要。
还应记住实时荧光定量PCR的灵敏度会放大微小的人为误差。
2.目标模板和连续稀释的实际样本的RT和PCR效率相当至关重要。
标准曲线生成——模板选择 如前所述，生成绝对标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。
尽管您可能需要均匀的纯模板进行初始拷贝数测定和标准曲线生成，但最好使用与实验样本尽可能类似的目标模板。
由于诸如核酸提取和逆转录等步骤可影响反应的动态范围，所以应采用与实验样本尽可能相同的处理步骤。
下列类型的模板可用作绝对定量标准品：
1.DNA标准品：目的靶点的PCR扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆。
优点：易于生成、定量，可在适当的储存条件下维持稳定性。
缺点：无法进行qRT-PCR的逆转录步骤，大大影响了反应效率。
2.RNA标准品：目的靶点的体外转录RNA(图23)。
优点：结合了RT效率，最大程度地模拟了目的靶点。
缺点：需要耗费时间生成该标准品，因其不稳定，难以保持长期准确度。
RNA和DNA标准品的均质性意味着它们通常具有较实验样本更高的效率。
因此可将背景RNA(如酵母tRNA)插入标准模板中，形成更具异质性的环境，有助于平衡反应效率。
背景RNA可抑制cDNA合成率达10倍。
40 数据分析 图23.体外转录实验方案示意图。
利用实时荧光定量PCR生成的PCR产物可利用包含5’T7启动子的序列和包含3’poly(T)的逆转录引物重新扩增。
体外转录反应生成多聚腺苷酸化正义mRNA。
纯化后可将其准确定量并稀释，用于生成标准曲线。
图24.用于标准曲线生成的反应板设置。
计算平均阈值循环(Ct)值时，应除去重复反应中的最高值和最低值。
标准曲线应用——cRNA 为说明应如何遵循绝对定量标准曲线的建议，本部分将逐步介绍此定量方法中cRNA标准曲线的构建。
T7RNA聚合酶可利用质粒或PCR产物，用于生成均质的目的转录本。
由于其检测限较广且准确性更佳，因此建议采用互补RNA(cRNA)荧光检测，而不是紫外吸光度测量。
另一种精确的定量方法是数字PCR。
测定拷贝数后，以cRNA比tRNA1:100的比例加入不相关的酵母tRNA，模拟生物样本的正常背景。
然后将该标准品稀释至少5至6个数量级，用于实时荧光定量PCR中的Ct测定。
加样不准确对绝对定量数据影响较大。
适当的预防措施可尽量减小这种影响。
如图24反应板设置所示，制备三个单独的cRNA稀释梯度，每个梯度的每个稀释样本重复扩增两次。
必须记住，稀释梯度应涵盖实验样本可能出现的所有模板量。
例如，如果未知检测样本可能只含有10个拷贝，则标准曲线中的最低点不应包含100个模板拷贝。
每个稀释度获取六个Ct值。
除去最高和最低Ct值，计算剩余四个Ct值的平均值。
如果我们关注此样本中的10-4稀释度(图24)，我们可以观察到特定样本的Ct值在2个循环中是如何变化的。
通过指定稀释度(对应特定拷贝数)为21.4——平均Ct值，可使上述差异最小化。
4 41
4 数据分析 4.3相对定量 相对定量尽管仍存在技术挑战，但不像绝对定量那样严峻。
该技术适用于大多数基因表达研究，可分析校准(正常)样本和一个或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。
采用该技术无需精确测定拷贝数，而是关注与校准样本相比的倍数变化。
我们在此列出了相对定量的常用方法，以及各自是如何控制差异的。
相对定量算法——ΔCt 这是最基本的相对定量形式。
获取检测和校准样本的目的基因表达的Ct值，两者之间的差异为ΔCt。
倍数差异为2的ΔCt次幂。
倍数差异=2ΔCt 该方法不控制样本数量、样本质量或反应效率的差异，还存在不足(图25)。
相对定量算法——ΔΔCt ΔΔCt方法是一种非常普遍的技术，它比较了包括校准品(如未处理或野生型样本)和标准品(如看家基因表达)在内的实验样本的结果。
采用该方法，可根据检测样本和校准样本中的标准品(正常)基因的Ct调整同样两个样本中的目的基因(GOI)的Ct。
其得出的ΔΔCt值可用于测定表达的倍数差异。
倍数差异=2-ΔΔCt ΔCt样本-ΔCt校准品=ΔΔCt CtGOIs-Ct正常s=ΔCt样本 CtGOIc-Ct正常c=ΔCt校准品 ΔΔCt方法要求标准品和靶基因的效率相同。
无疑明显的问题是：可接受的偏差范围是多大？确定该范围的方法是采用同样的样本生成标准品基因和目的靶基因的标准曲线(图26)。
可获得每个稀释度的标准品和靶基因的平均ΔCt。
数值本身并不重要；重要的是各个稀释度的值的一致性。
对于一些研究人员而言，这些小的效率偏差仍可导致数据不准确。
采用目的基因和标准品校正可使扩增效率差异最小化。
相对定量算法——标准曲线法 相对定量的标准曲线法采用检测和校准样本的靶基因之间的Ct差异，利用参考基因Ct进行标准化，调整扩增效率的微小差异。
采用此方法需要利用标准曲线确定标准品和目的基因的扩增效率，但无需采用前面的技术的前提。
该技术要求所有分析样本中的标准品基因必须相同。
图25.处理样本和校准品中的表达相对定量。
处理样本和校准品重复运行 两次；校准品Ct为
6，处理样本为12。
根据ΔCt方法，计算得出的处理样本中靶基因的相对表达水平较校准品低64倍。
但由于未使用标准品，该结果 的实验差异效应未知，因此结论可靠性较低。
42 数据分析 在图27中， 倍数差异=(E靶点)ΔCt靶点/(E标准品)ΔCt标准品 E=标准曲线E的效率=10[-1/斜率] ΔCt靶点=CtGOIc-CtGOIs ΔCt标准品=Ct正常c-Ct正常s 倍数差异方程摘自
M.W.Pfaffl的A-ZofQuantitativePCR一书。
要获得最准确的效率值，应仔细选择标准曲线中的校准样本。
该校准样本应经过同样的纯化步骤，运行同样的反应，且复杂度与实验样本相当。
因此，最佳校准样本是含有目的靶点的异质性样本——例如，从待研究的细胞系或组织中提取的总RNA。
值得注意的是，校准样本和实验样本之间的任何差异均可导致效率校正不准确，从而使基因表达的倍数变化计算变得不准确。
由于无需检测拷贝数，因此可随意稀释。
该技术采用了与ΔΔCt方法相同的扩增曲线设置，结合标准曲线中的效率值(在同一块反应上运行)调整标准品和目的基因(GOI)Ct值。
利用上述两个斜率计算效率(图27)。
简而言之，选择定量策略的第一步是确定绝对定量或相对定量哪种能最好地解决问题。
如果您需要知道样本中有多少靶分子，则需要利用已知量的目标模板生成精确的标准曲线。
在大多数情况下，相对定量是首选的方法。
ΔCt方法未采用标准品，而ΔΔCt方法则利用一个或多个参考基因，对实时荧光定量PCR的处理差异进行标准化。
利用标准品可计算倍数变化(需要或不需要调整反应效率)。
图26.相对效率曲线。
ΔCt范围为2.0至2.5。
以稀释度或起始RNA量作图，获取斜率。
完美的直线(斜率=0)表示所有起始浓度的效率一致，采用 ΔΔCt方法时，斜率<0.1一般被视为可接受的范围。
4 图27.利用标准曲线获取效率值，调整标准品和目的基因Ct值。
HeLaRNA连续稀释6个数量级，进行实时荧光定量PCR，生成标准品和目的基因 (GOI)标准曲线。
43
4 数据分析 4.4高分辨率熔解曲线(HRM)分析 高分辨率熔解曲线(HRM)分析是一种全新的均匀闭管PCR后分析方法，适用于SNP、新型突变和甲基化图谱的鉴别。
HRM分析是一种较传统熔解曲线分型更灵敏的方法，它监测双链DNA解离为单链DNA的温度。
此温度称为Tm，或产物的熔解温度。
高分辨率熔解曲线分型需要具有高级光学和热学性能的实时荧光定量PCR仪和分析软件，用于实现超快数据采集和高度准确的热学控制和一致性。
QunatStudio™12KFlex、QunatStudio™6/7、ViiA™7、7900HTFast、7500Fast、StepOnePlus®和StepOne®实时荧光定量PCR系统、Rotor-Gene®6000系统(CorbettLifeScience)及LightCycle®480系统(RocheDiagnostics)是目前可用于HRM分析的商品化仪器。
在HRM分析中，在包含高性能双链DNA(dsDNA)结合染料的混合物中采用PCR扩增约80–250bp基因片段。
MeltDoctor™HRMMasterMix采用了MeltDoctor™HRM染料，它是一种热稳定型的荧光SYTO®9染料，在双链DNA存在的情况下具有低背景荧光和高亮度。
在40个循环之后，扩增产物退火，并发出大量荧光。
当HRM分析开始后，实时荧光定量PCR仪缓慢升温，同时记录扩增片段的荧光数据。
随着PCR产物开始变性(或熔解)，荧光染料释放，荧光强度慢慢下降，直到温度接近PCR产物的Tm。
在十分接近Tm时，随着样本从双链解离为单链DNA，可观察到荧光强度显著下降(图28)。
图28.PCR扩增片段的熔解曲线特性。
特定的DNA序列具有特征性的熔解曲线。
可通过Tm变化或熔解曲线形状的改变检测出突变。
与传统的熔解曲线分析不同，HRM可区分出单核苷酸差异的扩增片段。
该技术为dsDNA结合染料开创了诸多新应用领域。
采用传统方法，上述应用领域需要针对各个靶点的独特荧光探针，代价高昂、设计耗时费力，且不灵活。
采用dsDNA结合染料的HRM提供了与基于探针的分析同样的性能，且价格更低廉，形式灵活。
HRM分析应用领域 最广泛的HRM分析应用领域是基因筛查。
基因筛查是搜索PCR扩增片段中是否存在未知变异，它可在测序步骤之前进行或者作为替代测序方法。
由于PCR产物突变可导致DNA熔解曲线的形状改变，因此它可以利用HRM分析检测。
杂交双链DNA样本扩增并熔解时，其熔解曲线不同于纯合野生型或突变样本。
尽管HRM的应用领域很多，但单核苷酸水平的区分更具挑战性，因其必须检测出微小的Tm改变。
HRM分析试剂 除专业仪器和软件外，HRM分析还需要能够区分单个核苷酸差异的扩增片段熔点的dsDNA结合染料。
已成功应用于HRM分析的染料包括： 一些常见的HRM分析应用领域包括： •基因筛查(突变研究)•突变分析•单核苷酸多态性(SNP)检测•杂合性研究•物种鉴定•甲基化分析 •MeltDoctor™HRM染料(ThermoFisherScientific)•MolecularProbes®SYTO®9染料(LifeTechnologies ThermoFisherScientific)•LCGreen®和LCGreen®Plus+试剂(Idaho Technology)•EvaGreen®染料(BiotiumInc.) 44 HRM分析成功的关键 •设置合适的升温速率。
通常需要每一个Ct产生10-20个数据点用于HRM的分析。
•保持较短的扩增片段，实现最高的灵敏度。
与较大的扩增片段相比，100bp左右的扩增片段可简化单核苷酸熔解曲线的检测。
•确保PCR扩增片段的特异性。
错配产物和引物二聚体可使数据解释复杂化。
引物浓度低于200nM，MgCl2在1.5mM至3mM范围及使用热启动DNA聚合酶将有助于获得高特异性。
采用标准的低分辨率熔解曲线评估错配。
无模板对照(NTC)熔解曲线对特异性评估至关重要。
•避免扩增包含除目的基因外的其它差异基因的区域。
检查PCR产物的种属同源性、外显子/内含子边际、剪接位点及二级结构和折叠。
•所有待分析的靶点均维持相似的荧光平台及相似的PCR产物量。
待比较样本量的差异可影响熔解温度和混淆HRM分析。
采用类似的起始样本量十分有用。
•确保反应使用足够的模板。
一般而言，Ct应低于30，以生成足够的材料，实现准确的熔解分析。
•提供充分的熔解数据采集窗口。
例如，窗口应在扩增片段熔解温度的上下10°C范围内(Tm±10°C)。
需要足够的熔解前和熔解后温度数据，实现准确的曲线标准化和高重复相关度。
•对于一些仪器，我们还建议在扩增后加入50°C预维持步骤(但在熔解之前)，以确保所有产物已重新关联，并有利于杂交双链形成。
使用混合物(如MeltDoctor™HRMMasterMix)，实现目的基因片段的灵敏且无偏差扩增。
数据分析
4 45
4 数据分析 4.5多重实时荧光定量PCR分析 多重反应技术是在同一个实时荧光定量PCR反应中分析超过一个靶点。
利用一种特定的染料、靶点特异性的荧光探针或引物对结合物区分每个靶点。
多重反应常用于在同一反应中扩增标准品基因和目的基因。
理论上，某个反应中可扩增的靶点数仅受可被实时荧光定量PCR仪激发并检测的具有不同光谱的染料数限制。
但仍有其它实验障碍存在：反应中的不同引物对和/或探针不得相互作用，这些引物和探针需分享PCR组分，如dNTP和热稳定DNA聚合酶。
多重反应的优化时间较长，但具有几个显著的优点： •差异较小，一致性更高。
在同一管内对标准品和目的基因进行多重反应，消除了这两个靶点在不同(即便相邻)孔内扩增可出现的孔间差异。
•试剂用量更少，成本更低。
多重反应只需较少的反应即可分析相同数目的靶点。
•更高的通量。
利用每次实时荧光定量PCR反应及每个样本可分析更多的靶点。
多重反应分析成功的关键 成功的多重反应必须考虑下列多个因素： •引物和探针设计•试剂优化(包括引物浓度、靶点丰度、反应组分和荧 光基团/淬灭剂组合)•多重反应分析验证 引物和探针设计 引物和探针设计无疑是多重反应分析中最重要的因素。
随着反应复杂度的提高，引物和探针形成二聚体的可能性也随之升高，竞争反应组分将限制一个或多个靶点的扩增。
下面是一些尤其重要的因素，可实现性能最大化并最大程度抑制竞争效应： •保持较短的扩增片段。
引物设计的扩增区段在60bp至150bp范围内将提升反应效率。
•设计引物的Tm值差别在1°C范围内。
请记住，所有引物和探针将在同一个温度下退火。
错配的Tm将导致效率偏差。
•进行引物和探针设计BLAST搜索，确保其针对目的靶点的特异性。
•使用引物设计软件确定引物或探针序列是否容易形成二聚体。
一款免费的程序AutoDimer(由美国国家标准与技术研究院的
P.M.Vallone编制)可分析特定的多重反应中的所有引物设计，了解其是否容易形成二聚体。
另一款软件MultiplePrimerAnalyzer也可在ThermoScientific™网站上获得。
试剂优化 多重反应的关键问题是不同扩增靶点的试剂之间的竞争。
确保高扩增效率需要降低引物用量，或者提高所有组分的浓度，或两者兼具。
大多数的优化实验都是从测试不同引物浓度开始的。
引物浓度和靶点丰度 多重反应中各种扩增片段的数量各不相同，扩增效率同样如此。
限制更易扩增或丰度更高的靶点的引物浓度可提供一个公平竞争的平台。
例如，如果β-actin(高拷贝标准品)与低丰度靶点进行多重反应，则共享的反应组分可能在早期循环即已耗竭。
降低β-actin的用量可限制其扩增效率，使较低丰度的靶点更易于扩增。
一般而言，对于更高丰度的靶点，您应采用不使Ct延迟的最低引物浓度。
反应组分浓度 每个多重反应各不相同，但调整引物浓度的方法最有可能达到多重和单重反应Ct值的一致性。
也可增加TaqDNA聚合酶、镁离子和dNTP的用量，并增强缓冲液的强度来提高所有靶点的灵敏度和扩增效率。
46 数据分析 荧光基团/淬灭剂组合 多重反应中的报告荧光基团必须具有独特的光谱，使各荧光信号可在单个通道中分别检测。
采用适当的染料，实时荧光定量PCR仪激发和发射光学元件能够过滤任何一点由错误的荧光基团发出的荧光(这种干扰又称为重迭噪声)。
同样的，随着多重反应中探针数量的增加，各个双标记荧光探针的淬灭剂选择也变得越来越重要。
荧光淬灭剂(如TAMRA™染料，FAM™染料的一种常见淬灭剂)可在不同的波长释放荧光基团的能量。
在多重反应中，该染料的淬灭剂可在不同波长产生多个信号，增加了过滤及数据完整性的难度。
而Dark淬灭剂，如NFQ或QSY®淬灭剂，以热量而不是荧光的方式释放能量，从而降低了整体荧光背景。
根据您使用的仪器的检测能力，选择适当的多重反应染料组合。
验证多重反应分析 与单重实时荧光定量PCR分析一样，多重反应也应建立标准曲线，先评估多重反应中所有靶点的反应效率，然后运行分析。
此验证过程包括两个主要阶段：
1.验证各靶点的引物和/或探针，确定各自的效率。
这是引物和探针设计的初始评估。
2.优化多重反应分析的整体效率。
单独评估各个引物和探针组，确定设计和条件是否适用于此靶点。
这是通过连续稀释的标准曲线完成的，同样试图达到近100%的效率。
在各引物/探针组合经过功能验证后，继续进行多重反应优化。
值得注意的是，当对靶点进行多重反应时，单重反应的引物/探针浓度条件并非最佳。
构建多重反应检测板时，建议在条件允许的情况下每次添加一个靶点，而不是在第一次实验中整合所有靶点。
使用相同的标准曲线方法，结合所有引物和探针，针对各个稀释度进行多重反应。
将各个靶点的效率与其相应的单重实时荧光定量PCR反应效率相比较。
理论上，单重反应和多重反应的标准曲线变化极小。
如果多重反应靶点的反应效率变化超过5%或者超出90-110%的理想范围，则需要优化多重反应分析的引物/探针浓度或其它组分。
多重反应的Ct值应与单重反应相当，使反应的灵敏度不受影响。
4 47 疑难解析
5 5.1引言5.2常见问题 疑难解析 5059 5 49 疑难解析 5.1引言 实时荧光定量PCR分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果。
在研究新基因或改变分析参数时，必须对分析进行验证，并调整所需的反应。
该过程包括调整引物浓度、热循环温度和时间，然后通过标准曲线评估确定参数。
优化过程确实需要时间，但是所花的时间是值得的。
这样得出的分析结果不仅具有最高的灵敏度和最大的动态范围，而且效率高(与高准确度相关)，重复性好。
这些因素使数据具有可靠性，并最终为研究界所接受。
解决实时荧光定量PCR反应过程中出现的问题似乎令人畏缩。
但是，如果将适当的Assay设计考虑在内，实时荧光定量PCR的常见困难可归结为四个主要方面： •引物二聚体的形成•引物和探针的储存•实时荧光定量PCR的抑制和较低的反应效率•软件分析设置 引物二聚体的形成 当引物对之间的部分序列存在同源性时，可形成引物二聚体。
如果在PCR反应过程中引物退火形成二聚体，则TaqDNA聚合酶可延伸二聚体，形成长于原始引物的产物，它可导致循环过程中更易出现退火错误。
根据长度的不同，引物也可能出现自身折叠，由此与模板形成冲突。
反应的复杂性(尤其在多重反应过程中)可使上述不良影响发生的几率增加。
引物二聚体的形成是您在实时荧光定量PCR设计和验证过程中最常见的问题之
一，但在实时荧光定量PCR反应中解决该问题的途径很多。
在讨论如何解决之前，最重要的是了解为何应减少二聚体的形成。
引物二聚体引发的问题 引物二聚体对反应的影响在很大程度上取决于反应中采用的化学物质。
基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不是很大，这是由于在引物二聚体区域极少出现探针退火及断裂的现象。
此时，引物的竞争作用是需要考虑的主要问题。
另一方面，基于双链DNA结合染料的反应受引物二聚体的影响很大，这是因为染料的结合方式为非特异性的，由此可导致反应过程中监测到的荧光信号增强。
这可相应改变Ct值，使结果出现偏差。
外部信号是影响反应效率的最重要因素，而反应孔内的竞争作用也会对其产生直接的影响。
如前所述，较低的反应效率可使动态范围缩小，由此造成灵敏度下降。
最好在引物设计阶段就采取简单的预防措施，从一开始即避免二聚体的形成。
有几款免费工具可协助完成上述过程。
其中一种工具是AutoDimer(由美国国家标准与技术研究院的
P.M.Vallone编制)，它可以从理论上对引物对的序列进行分析，并标记出那些易形成二聚体的序列。
尽管以生物信息学为基础的引物设计可以降低二聚体形成的可能性，但仍需要通过实验对其进行监测。
确定是否存在引物二聚体 凝胶电泳是显示引物二聚体的一种极佳的方法。
如图29所示，引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100bp以下。
在PCR过程中，二聚体的形成与模板的退火及延伸之间存在竞争作用。
引物二聚体通常随模板的减少而增加。
单独采用凝胶电泳分析进行验证的缺点在于，其灵敏度最低仅达到纳克级，因此可能无法得出结果。
凝胶电泳分析的优势是当解离曲线(熔解曲线)数据同时可用时，产物的大小有助于对结果进行综合解释。
5 图29.琼脂糖电泳分析引物二聚体的形成。
热循环反应之前，核酸样本经系列稀释并与PCR反应液混合，相同体积的反应混合液加入琼脂糖凝胶，引物二聚体为胶底部的扩散装条带。
50 疑难解析
A B 图30.扩增曲线和熔解曲线中突出显示了特异性扩增(A)和引物二聚体效应(B)。
可利用NTC样本在扩增曲线中产生的信号和熔解曲线中多余的峰在图(B)识别出引物二聚体。
解离曲线，又称熔解曲线，是利用双链DNA结合染料获得的标准反应热廊线。
如果扩增具有极好的特异性，则实时荧光定量PCR板上每个反应孔的解离曲线将出现一个较窄的单峰。
引物二聚体的荧光强度较低，呈较宽的“波形”，显示其在70°C左右熔解。
出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。
如数据分析部分所述，若对解离曲线中是否存在引物二聚体有任何疑问，可将观察的结果与NTC反应孔相比较。
当模板不存在时，更易出现引物二聚体峰(图30)。
减少或去除引物二聚体 如果出现了引物二聚体，有许多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体。
1.首先是优化热循环条件，这主要是提高退火温度。
大多数情况下，两步循环(由95°C变性步骤直接进入60°C退火和延伸步骤)有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为60°
C。
2.可降低引物浓度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的帮助。
大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为200nM，但如有需要，可将浓度降至60nM。
3.镁的最佳浓度一般约为3mM。
高于此浓度易形成引物二聚体。
4.如果未对引物形成二聚体的倾向进行评估，则应补充评估并考虑重新设计(如有需要)。
通常情况下，最好使用热启动DNA聚合酶，并在冰上进行反应。
5.在理论上，针对同一靶点应同时检测多个引物组。
这实际上可以节省大量时间，因为如果这些引物中的一个能立即发挥作用，则可以减少花费在优化过程上的时间。
请记住，由于在引物对存在的情况下，RT反应的温度更低，因此二聚体在一步法qRT-PCR反应中可能更值得关注。
另外还须注意，有些情形下引物二聚体并不是一个值得担心的问题。
例如，如果只是在NTC孔里出现，或者样本孔和NTC孔的ΔCt值的差异是大于10(因为这表明来自引物二聚体的荧光信号可以忽略不计。
)
5 51
5 疑难解析 引物和探针的储存
A 尽管引物和探针的储存经常被忽略，但其在保证实时荧光 定量PCR分析的长期成功和一致性方面具有重要作用。
影响引物和探针的稳定性的主要因素是储存温度、储存时 间、是否被长时间暴光、储存的引物和探针的浓度以及储 存溶液的组分。
引物和探针储存不当引发的问题 引物和探针储存不当可导致降解及特异性丧失，进而对反
应效率造成影响。
在基于荧光标记的引物和探针的分析中，降解的探针可释放出游离染料，从而导致背景增加以及信噪比降低。
由于其荧光强度较低，因此上述现象可使扩增曲线显得极为粗糙。
附于引物和探针上的荧光染料也会逐渐发生光漂白作用，从而很难在实时荧光定量PCR仪中被检测出来。
确定引物或探针的完整性是否受到影响 确保引物和探针的稳定性的首要预防措施是对储存时间进行简单的监测。
大多数情况下，引物和探针的稳定性可达一年(或者更长时间)。
但储存条件不当时，可在6个月内观察到储存相关效应。
评估引物完整性的最佳方法是连续利用标准曲线。
复制不 准确及解离曲线中存在多个峰(尤其是以前未曾出现过的)
B 是稳定性降低的常见指征。
至于荧光标记的探针和引物，在仪器的多组分视图中观察到超过正常水平的背景荧光即可视为探针降解。
如果荧光探针和引物未降解而染料本身出现降解，当有产物形成但无法在实时荧光定量PCR仪中检测出来时，可通过溴化乙锭染色的凝胶显色。
图31中的标准曲线突出显示了储存不当的引物产生的效应。
图31A中的扩增曲线受到了降解引物的消极影响，而图31B中的曲线则是储存适当的引物的预期结果。
熔解曲线插图可提供更多详情，显示其中存在多种非特异性产物。
图31.扩增曲线分别显示了储存不当的引物(通过熔解曲线和背景荧光显示)(A)与储存适当的引物(B)产生的效果。
52 疑难解析 长期保持引物和探针的稳定性 保持引物和探针的稳定性的关键有四点。
低压冻干的引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。
引物一旦重新溶解，即应置于-20°C保存，且若保存时间超过一年则应对其进行监测，看它是否出现功能下降。
对于标记的引物和探针，则应采取措施避免标记物暴光(例如使用不透明管及置于暗处保存)，以延长它们的使用寿命。
最后，引物浓度也可影响其稳定性。
建议引物的储存浓度不低于10μM；实际上，在大多数情况下，100μM的引物浓度操作更简单。
引物和探针还应分装保存，以减少冻融次数，特别是标记的引物和探针。
最后，TE缓冲液可形成比水更为稳定的环境。
此外，含有0.1mMEDTA的TE缓冲液(标准TE中含有1mMEDTA)是一种理想的溶液，这是由于一些PCR反应对EDTA的灵敏度可能有一些残存。
NTC扩增 如前所述，当引物二聚体形成时，如果使用与DNA双链结合的染料，在NTC反应中也可观察到荧光信号。
也存在另一种情况，引物二聚体的扩增也会在NTC孔中被观察到。
无论是基于探针还是双链DNA结合染料的反应，在存在污染物的情况下，也可看到晚期扩增。
这可能是一种随机事件，并不是所有NTC都会出现扩增，通常是由不常见的加样错误引起。
如果在每一个NTC反应里都出现扩增，很可能是其中一种或两种试剂被污染了。
可采用以下步骤防止或去除污染。
1.使用干净的工作台，用带核酸降解试剂的的溶液擦抹工作台面。
2.用带dUTP和UDG的反应预混液降解来自前序PCR反应的产物，防止前序PCR反应的污染。
3.用新的反应管尽量通过置换不同来源的试剂，发现出现问题的试剂。
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