worldleaderinservingscience 常见问题一:抑制物（Inhibition）
2 扩增曲线斜率不一致提示存在抑制物 •在指数增长期，扩增曲线的斜率应当有良好的一致性，即所有的曲线都应该是平行的。
•如果扩增曲线的斜率不一致，就提示可能样本的质量不好。
PCRinhibitors?

3 PCR抑制物 •黑色素•多糖类•血红蛋白•尿素•其他
4 •乙醇•蛋白酶K•胍盐•苯酚 检查样本质量 •用分光光度计测量样品260/280比值。
•DNA纯度：OD260/OD280=1.8•RNA纯度：OD260/OD280=2.0 •将样品梯度稀释，制作标准曲线
5 标准曲线检查DNA样本质量 •以一个高浓度的样本(cDNAorgDNA)作为起始样本•对样本进行梯度稀释•每个稀释度重复三次进行绝对定量实验•检查标准曲线的线性
6 抑制物的存在导致PCR过程受到抑制 •正常标准曲线所有的点都应该落在同一条线上 Inhibition •抑制物的影响可以通过稀释样品消除
7 抑制物同时会抑制逆转录反应 •以RNA为起始模板,也会受到抑制物的影响。
•逆转录很容易受到抑制物的影响,使得cDNA的产量下降.•检测不同浓度RNA进行RT的效率是检测是否存在抑制物的好方法。

8 如何检测RT反应中的抑制物?
制作RNA标准曲线
9 如何制作RNA标准曲线？ RNA(undil.)1:10dilution1:1001:10001:10,000 RT cDNA RT cDNA RT cDNA RT cDNA RT cDNA 用同样的方法提取的一组未知RNA，选择一个高浓度的RNA作为起始模板。
10 如何制作RNA标准曲线？ RNA(undil.)1:10dilution1:1001:10001:10,000 RT cDNA 10ul RT cDNA 10ul RT cDNA 10ul RT cDNA 10ul RT cDNA 10ul 将每个梯度的RNA都逆转录为cDNA；注意每个逆转录反应的体积应该一致。
11 Finally
... 运行绝对定量生成标准曲线，注意加入cDNA的模板量应该一致。
12 查看RNA标准曲线的线性 1:10,0001:1000 (每个点三次重复) Ct 1:100 1:10 undil. Initial[RNA] 13 查看RNA标准曲线的线性 Ct Q:造成这种曲线的原因是什么?
A:RT步骤有抑制物存在 Initial[RNA] 14 强抑制物存在的例子 Ct Completefailureonhighend Initial[RNA] 15 常见问题二:重复性差 16 实验结果的重复性 •为精确定量，对每个样品我们都要做重复实验（通常至少为3个重复）。
•目标是所有复孔CT值都相近。
•这样，试验结果就有很好的精确度。
17 重复性好 40次相同的重复 (Std.devofCt=0.03) 18 重复性差 3次相同的重复 (largedeviationinCts) 19 造成重复性差的原因 •基线，阈值设置•加样误差(操作?
加样器?
)•没有将试剂和样品充分混匀•低拷贝的样品泊松分布•没有使用ROX校准 20 造成重复性差的原因 •基线，阈值设置•加样误差(操作?
加样器?
)•没有将试剂和样品充分混匀•低拷贝的样品泊松分布•没有使用ROX校准 21 基线设置太低影响精确度和准确度 基线终止位置设置太低（3-6） 22 手动设置基线 起始位置：基线起始值（Start）设置为3...不同试剂？ 23 手动设置基线 终止位置：基线终止值（End）设置在信号上升之前 信号在20个循环开始上升 24 基线终止位置向后调整 25 基线设置太高 “Doublewaterfalleffect” 26 基线终止位置向前调整 27 如何手动设置阈值 最佳位置:指数增长期内，曲线重复性最好的位置 28 造成重复性差的原因 •基线，阈值设置•加样误差(操作?
加样器?
)•没有将试剂和样品充分混匀•低拷贝的样品泊松分布•没有使用ROX校准 29 反应液混合不均匀 •有时候在制备PCR反应液时(包括mastermix、探针引物、纯水)，在分装入反应板（管）前没有充分混匀。
•结果加入到每个孔中的试剂成分就有所不同。
30 反应液混合不均匀导致重复性差 linearviewlogview 31 反应液混合不均匀导致重复性差 TopofplateMiddleofplateBottomofplate 32 解决方法 •在分装反应液之前，要将反应液充分混匀（振荡，吹打）•同时上机之前，要将PCR管或者PCR板离心，使所有的液体都在反应管底 部。
33 造成重复性差的原因 •基线，阈值设置•加样误差(操作?
加样器?
)•没有将试剂和样品充分混匀•低拷贝的样品泊松分布•没有使用ROX校准 34 泊松分布 10μL10μL10μ
L 9moleculesin30uL每个反应管均匀的分配到3个模板的几率有多高？如果每30uL含有9000个模板呢，又会怎样呢？ 35 造成重复性差的原因 •基线，阈值设置•加样误差(操作?
加样器?
)•没有将试剂和样品充分混匀•低拷贝的样品泊松分布•没有使用ROX校准 36 ROX重复性 进行ROX参比染料校准的36个复孔分析结果 未进行ROX参比染料校准的36个复孔分析结果 37 ROX校准:参比荧光 MasterMix中ROX浓度固定ROX不参与PCR扩增，信号强度 只与MasterMix用量有关ROX的功能：校准物理误差耗材质量：管盖厚度、透光性能仪器稳定性：孔间、批间波动反应体系监控：蒸发 光学系统凝结溶液 RRepooxrterReporterRn=RFAM/RROXRn Rox 38 卤素灯盖子 体积 Rn ROX设置 •仪器软件自动进行ROX校准。
•ROX校准为可选步骤，如果使用的PCR试剂没有添加ROX，或者ROX添 加浓度不合适，请将ROX校准关闭。
39 ROX浓度不合适或未添加 40 修改软件中ROX的设置 41 如果反应体系存在蒸发也会导致重复性差 •
ROX信号在反应过程中并不是完全平直。
•但是如果ROX信号有突然上升的现象（类似扩增的信号），则提示该反应 孔有蒸发。
−查看问题反应孔的体积是否有变化 42 常见问题三:“可疑的”扩增曲线 43 真正的扩增曲线vs非扩增曲线 •由PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。
•有特征的形状：首先背景信号，然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期） 44 案例1:是否存在扩增？ •一些形状和正常的扩增曲线有区别的曲线，该如何判断呢？正常的扩增曲线平台期很低 45 如何判断它们是真正的扩增？ •同时也具有特征性的三个增长阶段。
46 如何判断它们是真正的扩增？ •同时也具有特征性的三个增长阶段。
•这些曲线都有典型的指数增长期，而且和其他的曲线平行（虽然比较短）。
47 是什么原因造成平台期很低呢?
•可能是目标样品的浓度太低。
•通常如果模板的起始浓度太低,反应体系中会形成大量的引物二聚体。
48 引物和模板的比例 Addprimer 49 引物和模板的比例 Addprimer 50 是什么原因造成平台期很低呢?
•可能是目标样品的浓度太低。
•通常如果模板的起始浓度太低,反应体系中会形成大量的引物二聚体。
•大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。
51 是否可以调整引物和模板的比例？ •低引物浓度会导致高Ct值(灵敏度低)。
•所以对于低浓度的样品，反应体系中引物的浓度却不能太低。
52 引物浓度和灵敏度 900/900nM300/300nM 50/50nM 53 案例2:是否存在扩增？ ?
54 如何判断它们是否存在扩增？ •首先，和同一反应中的其他扩增曲线相比，这些曲线的形状不相同。
55 如何判断它们是否存在扩增？ •同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。
56 如何判断它们是否存在扩增？ •其次，看Y轴的数值。
•这些“可疑”曲线的指数增长期范围常常是落在1e-2的范围内。
对数图 57 如何判断它们是否存在扩增？ •最后，看线性图。
•曲线一直没有上升的趋势，提示不存在扩增。
58 案例3:是否存在扩增？ •右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但是曲线不光滑。
59 有没有发生扩增?
•切换到线性图，可以看到曲线有一定的上升。
60 案例三分析 •这些样品在反应的最后阶段才开始扩增，平台期很接近背景。
所以它呈锯齿状，不光滑。
•虽然我们可以认为这些样品是临界阳性，但是对这些样品的定量结果都是不太准确的。
•形成这类曲线的原因可能是模板的质量差(RT/PCR抑制物;模板浓度低)，也可能是引物探针的设计问题。
•试剂原因 •如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致扩增曲线的指数增长期会变得很短，或者没有。
•荧光信号差的试剂也会有同样的问题。
61 定量PCR数据常见故障排查 对PCR原理的了解是基础，一切从原理出发。
运用不同的工具解决问题： 扩增曲线： −查看扩增曲线的形状：是否有明显扩增阶段（特别是指数增长期）?
所有的曲线是否平行?
−查看Y轴的数值：是否高于背景信号?
−查看线性图：曲线是否有明显的“takeoff”？ 标准曲线：扩增效率是否一致原始数据：各组分的原始荧光表现 常见的问题归类： 抑制物：制作标准曲线查看重复性差：基线/阈值设置，加样/混匀，泊松分布，参比荧光可疑的扩增：综合各种图谱分析 62 Questions?
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