共聚焦显微镜快速入门 占成 Zhancheng@ 北京生命科学研究所 „共聚焦显微镜历史简介„共聚焦显微镜原理简介„LSM510META系统简介„LSM510META快速上手„影像中心的管理规定简介 —北京生命科学研究所— 共聚焦显微镜历史简介 —北京生命科学研究所— 传统显微镜的缺憾 „在传统的荧光显微镜中，来自汞灯或者氙灯的激发光照射视野中的全部样品，观察者可以用眼睛直接观察，也可以用CCD等设备直接拍摄荧光图像。
„传统显微镜得到的图片容易受到轴向干扰和侧向干扰的影响而显得有些模糊。
—北京生命科学研究所— 焦点模糊 „对于有一定厚度的样品（大于2微米），一方面，由于在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激发，焦平面上的荧光图像将有一定的模糊，这被称为轴向（Z）干扰； „另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平面上邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的对比度降低，这被称为侧向（XY）干扰。
—北京生命科学研究所— 共聚焦显微镜优势 „共聚焦显微镜很好的解决了传统荧光显微镜中焦面模糊的问题，解决了图像的轴向和侧向的干扰。
„共聚焦显微镜同时还提供了光切能力，能对厚样品（例如花粉颗粒，果蝇大脑等）进行三维层切成像。
—北京生命科学研究所— 共聚焦显微镜发展历史 „1955年，MarvinMinsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。
„1957年，MarvinMinsky申请了共聚焦显微镜的专利。
„1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。
„1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可 以消除焦点模糊，得到清晰的图像。
„1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显 微镜。
—北京生命科学研究所— „由于目前多数共聚焦显微镜所用光源为激光，成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为“laserscanningconfocalmicroscope”,“激光扫描共聚焦显微镜”。
„激光共聚焦扫描显微镜发展至今，已经不再是普通的光学显微镜，而是光学显微镜与激光，高灵敏度探测器，高性能计算机和数字图像处理软件相结合的新型高精度显微成像系统。
—北京生命科学研究所— 共聚焦显微镜原理简介 —北京生命科学研究所— 共聚焦与传统显微镜的原理差别 „照明方式不同：传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用眼睛成像，也无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图象，有一定的时间延迟。
—北京生命科学研究所— Pinhole的作用 „共聚焦显微镜在探测器前放置一个pinhole小孔，用来阻止非焦面的信号，同时通过焦面的信号，以消除焦点模糊。
正是因为pinhole小孔的存在，共聚焦显微镜具有了光切能力，能对厚样品进行三维层切成像。
—北京生命科学研究所— 共聚焦的局限 „虽然共聚焦显微镜能获取比普通显微镜更清晰的图片，但实际上共焦焦显微镜的分辨率只比普通光学显微镜有少量的提高，普通光学显微镜的分辨率理论极限大约是0.2微米，共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是0.15微米。
„共聚焦显微镜的一大限制是成像速度较慢，这限制了其用来研究生物领域中的一些快事件。
—北京生命科学研究所— LSM510META系统简介 —北京生命科学研究所— 系统组成 „倒置荧光显微镜„激光器„扫描头„系统控制塔„电脑及显示器 —北京生命科学研究所— 倒置荧光显微镜Axiovert200M „Plan-NeoFluar2.5„Plan-NeoFluar5X„Plan-NeoFluar10X„Plan-NeoFluar20X„Plan-NeoFluar20Xcorrph2„Plan-NeoFluar40X„Plan-NeoFluar40XcorrPh2„Plan-Apochromat63X/OIL —北京生命科学研究所— 激光器 „405nm激光器„Ar离子激光器（458nm， 488nm，514nm）„HE-NE绿激光（543nm）„HE-NE红激光（633nm） —北京生命科学研究所— 扫描头 „2个荧光探测器„一个META探测器„一个透射探测器 —北京生命科学研究所— 系统控制塔 扫描头控制激光控制数据通信 —北京生命科学研究所— 系统功能简介 „用作高精度荧光显微镜 „获取三维图像„获取多荧光标记图像 —北京生命科学研究所— „时间序列扫描成像，可对样品进行长时间的动态观察，获取样品不同时间的图像。
„FRET实验 —北京生命科学研究所— „光谱扫描功能，既可拆分有光谱重叠的不同染料，也可以获取未知染料的发射光谱曲线。
—北京生命科学研究所— 串色 „串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。
—北京生命科学研究所— 串色的分类 „一类是：两个荧光染料的激发光谱没有重迭，但发射光谱有重叠。
这类荧光串色可以使用序列扫描（multi-track）的方法来排除：即先使用第一种荧光染料的激发光扫描一张图像，再使用第二种荧光染料的激发光扫描第二张图像。
„另一类是：两个荧光染料的发射光谱和吸收光谱都有重迭。
这类荧光串色只能使用光谱扫描（lambdascan）的方法来排除。
„本系统同时具备消除上述两种串色的功能。
—北京生命科学研究所— LSM510META快速上手 —北京生命科学研究所— 实验前 „欢迎使用LSM510META，在您来之前最好能将样品在其他普通的荧光显微镜上看过，确认之后再拿来。
—北京生命科学研究所— 开机流程（仅对有独立操作资格者） „开启电闸，此闸一般已经开启。
„开启系统总开关，“on”，你将会听到显微镜自检的响声。
„开启显示器，电脑。
„预热10分钟。
—北京生命科学研究所— „开启软件，进入“STARTEXPERTMODE”，系统进行自检，你将会再次听到显微镜自检的响声。
„打开汞灯开关。
—北京生命科学研究所— „点击“laser”图标，开启所需要的激光。
„开启AR离子激光时，先点击“standby”，再点击“on”，最后将激光的电流设置在25％（有利于激光器寿命）。
其他激光器，直接点击“on”即可开启。
激光开启完毕后，关掉该窗口。
—北京生命科学研究所— „点击“config”，设置系统成像光路，不熟悉如何设置，请由管理员代劳。
„点击“scan”，设置扫描参数，控制探测器的负高压，pinhole的大小，扫描速度，zoom大小，激光强度等参数。
—北京生命科学研究所— scancontrol窗口命令详解 „点击“MODE”，出现扫描象素精度，扫描速度，数据存储位数，平均次数，ZOOM大小等参数设置。
—北京生命科学研究所— Mode设置 „Framesize：控制扫描象素精度，指一幅图像由多少个象素点构成，由于受到共聚焦本身分辨率的限制，因此没有必要选择太大，一般低倍镜使用512X512即可，高倍镜选1024X1024即可。
此项也可在下面的框中直接输入数据。
„linestep指的是每隔多少条扫描线，开始采集数据，选择1即可。
„scanspeed：控制成像速度，速度越慢，信号越强，对样品的漂白也越大，反之亦然。
一般选择速度为7比较合适。
—北京生命科学研究所— „datadepth:图像的灰度等级。
„scandirection：控制扫描方式，一般选择前者。
„mode，method,number:一般用来确定平均的次数， 平均次数越多，图像的信噪比越好。
为了提高图像的质量，常用的方法为：提高scanspeed，同时提高平均的number，这样对样品的漂白也较小。
„ZOOM：图像的放大，增大ZOOM，能有助于看清图像的细节，但是ZOOM的增大是有限定的，这取决于共聚焦显微镜的分辨率，或者说取决于物镜的倍率。
例如在10X物镜下，当ZOOM超过10时，就没有多少意义了。
—北京生命科学研究所— „点击“channel”，出现pinhole大小，detectorgain，amplifieroffsect，amplifiergain以及激光强度等参数的设置。
—北京生命科学研究所— Channel设置 „pinhole：pinhole越大，信号越强，来自非焦面的干扰也越强，系统的Z方向分辨率降低。
一般选择为
1 „Airyunit时，能在信号强度和Z方向分辨率之间得到一个较好的平衡 „detectorgain：指探测器的负高压值，一般选取在650附近为佳，如果太低，则信号较弱，可能需要提高 „激光强度，这加大对样品的漂白，如果太高，则噪声也较高，且容易损害探测器。
不宜长时间超过800，也不宜低于500 —北京生命科学研究所— „amplifieroffsect：用于扣除背景噪声用，在扣除背景的同时也可能会对信号有影响，因此不宜过低。
„amplifiergain：信号的电子放大，一般选择为1即可，不宜超过
2。
„激光强度的控制：可根据样品信号的强弱，以及detectorgain的大小，以及样品是否容易漂白等综合因素来考虑。
不同激光的强度是不一样的，一般来说5％的488nm激光大约等于100％的543nm激光。
—北京生命科学研究所— „如果需要获取三维图像，点击“Zstack”。
—北京生命科学研究所— Zstack设置 „Markfirst/last：确定三维扫描时的最初位置和最终位置。
„选择最初位置和最终位置的时候，需要点击“FastXY”，一边扫描一边调节物镜的焦面，反向旋转微调钮到最初位置，点击“Markfirst”，再正向旋转微调钮到最终位置，点击“Marklast”。
„完成上述步骤之后，点击“Zslice”，然后点击“optimalinterval”以确定每隔多少厚度成一幅像。
„设置好“mode”和“channel”中的参数后，点击“start”开始获取三维图像。
„该窗口中的其他设置保持原始设置不变。
—北京生命科学研究所— 实验中 „实验过程中，经常需要先用显微镜找到样品，再用共聚焦来扫描图像，点击“眼睛”为显微镜观察模式，点击“LSM”为扫描图像模式。
—北京生命科学研究所— „显微镜的操作可以用软件实现，点击“显微镜”图标可以看到物镜，滤片，荧光，透射光的操作按钮。
也可以直接操作显微镜。
—北京生命科学研究所— 请勿动手动调焦物镜选择汞灯快门 卤素灯开关 样品台调节滤光片选择 —北京生命科学研究所— 调焦 „放样品时注意玻片不要碰到物镜表面，以免损坏镜头。
„在找焦距的时候，应先用低倍镜（5X或10X）粗调，再 细调。
操作中不应太快，太急，以免物镜顶住样片，损坏镜头（特别是在使用高倍物镜时，更应小心！）。
„调焦过程中，当听到报警声时，说明已经调到最低点，请立刻停止，并反向调节。
„实验时，请将样品表面的液体擦干，避免滴到镜头上，污染镜头。
使用油镜时，滴油不宜过多，使用完毕后，要及时清洗镜头。
—北京生命科学研究所— 扫描图像 „在扫描图像之前，请务必关掉汞灯的“shutter”，并点击“LSM”图标，然后开始扫描，这样有利于仪器的寿命。
„在“scan”和“mode”窗口中设置好初步的扫描参数。
—北京生命科学研究所— 获取图片通常的步骤 „在显微镜下找到样品的焦面，点击“LSM”图标，根据样品情况设置好“mode”和“channel”中的参数，点击“FastXY”，微调样品的焦面，使得图片最清晰，选择“palette”中的“rangeindicator”，调节“detectorgain”和“amplifieroffset”值。
一般来说认为图片中蓝色即将消失，红色即将出现的时候较好。
—北京生命科学研究所— 改善图片质量的通常方法 „对于背景较高的样品，适当降低“detectorgain”或“amplifieroffset”，或激光强度，再通过多次平均，增加图像的信噪比。
„如果图像不够亮，一般可以增加detectorgain和激光强度，但是优先考虑增加detectorgain，如果detectorgain超过800时图像依旧较暗，则可以考虑增加激光强度。
„如果图像过亮，优先考虑降低激光强度。
„对于细节较多和细微（小于1微米）的样品，例如神经细胞的 “spine”，选择高数值孔径的物镜是一个好的方法。
„以上只是提供一些基本的思路，具体要根据实际样品来操作。
—北京生命科学研究所— 实验后 „图像获取完毕后，可以对图像进一步处理，以得到更为漂亮的图片，这项工作你可以用photoshop等图像处理软件完成，本系统的软件也有一些简单的处理功能。
„对于二维平面图像，点击“contr”，可以调整图像的对比度，亮度，也可以点击“more”，对图片进行一些非线性的处理。
通俗地说，就是使图像上亮的地方更亮，暗的地方更暗，例如“Gamma”处理。
—北京生命科学研究所— 给图像加scalebar调整图片对比度 —北京生命科学研究所— 3D图像重建 yz x重建原理 —北京生命科学研究所— „对于zstack扫描后的图像，如果想重建为三维图像，步骤如下： „点击“3DView”，“projection”； „在projection窗口中设置重建参数。
—北京生命科学研究所— „点击preview；„可以对重建后的图片 进行处理，改变图像亮度，对比度等参数；„设置好之后，点击apply，保存重建结果即可。
—北京生命科学研究所— 数据存储 „在数据存储前，您需要先以自己的名字新建一个文件夹，将自己的数据和他人的数据分开存储。
„每次实验的时候，您也许需要在自己的文件夹下新建一个库文件，将文件分类存储。
—北京生命科学研究所— 关机流程（仅对有独立操作资格者） „从载物台上拿走样品„关闭汞灯开关„关闭激光，Ar离子激光需要 先点击“standby”，将“outputpower”降到最低，点击“off”关闭激光。
一定要等到status显示“connected”才可以退出软件和关闭电源。
其他的激光器直接点击“off”即可。
—北京生命科学研究所— „等待激光器彻底关闭后，退出软件。
„关闭电脑，显示器„关闭系统总开关，“off” —北京生命科学研究所— 影像中心的管理规章 —北京生命科学研究所— „提前预约； „实验前征得管理员同意，实验完毕后通知管理员； „不要自己操作仪器的开闭，不擅自改变仪器设置（激光器电流，安装物镜，安装滤片，更换汞灯）； „不要擅自改变室内通风及温度控制，保持室内卫生； „仪器出现问题，及时报告给管理员，不得擅自处理或隐瞒不报； —北京生命科学研究所— „具体的规章在OA系统/网上办公/显微镜室调度中； „如果您有任何意见和想法，请不要吝啬告诉我们。
非常感谢！ —北京生命科学研究所— 谢谢！ 该手册仅为研究所内部使用，未经允许不得他用。
—北京生命科学研究所—Version1.0（有待升级）