中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书
骨髓来源人MSC细胞说明书
目录号：SCSP-405细胞名称：骨髓来源人MSC细胞细胞描述：正常的骨髓来源的人间充质干细胞，具备分化成脂肪、成骨和软骨的能力。
据报道，该细胞CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD14、CD31、CD34、CD45表达阴性。
物种：人组织：骨生物安全等级：BSL-1细胞来源：2013年引进完全培养液配方：见下方备注【方案一】、【方案二】，我库目前使用【方案二】。
冻存日期/代数：详见冻存管/培养瓶标识。
（建议使用P10前细胞进行实验，若传代次数过多，MSC增殖能力将减弱）参考传代周期：34天参考传代比例：1213参考换液频率：见下方备注【方案一】、【方案二】。
冻存液配方：见下方备注【方案一】、【方案二】。
我库目前使用【方案二】。
细胞形态：纺锤形，成纤维样，贴壁生长支原体检测结果：阴性 骨髓来源人MSC细胞照片： 第1页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书 参考文献： AlMadhounA,etal.ChemicallyDefinedConditionsMediateanEfficientInductionofMesodermalLineagefromHumanUmbilicalCord-andBoneMarrow-MesenchymalStemCellsandDentalPulpPluripotent-LikeStemCells.CellReprogram20
(1):9-16,2018.PubMed:29412734 ZhengB,etal.QuantitativeicParticleImagingMonitorstheTransplantation,Biodistribution,andClearanceofStemCellsInVivo.Theranostics6
(3):291-301,2016.PubMed:26909106 WangM,etal.Coldatmosphericplasma(CAP)surfacenanomodified3Dprintedpolylacticacid(PLA)scaffoldsforboneregeneration.ActaBiomater46:256-265,2016.PubMed:27667017 LiuCJ,etal.SuppressionofIL-8-Srcsignallingaxisby17β-estradiolinhibitshumanmesenchymalstemcells-mediatedgastriccancerinvasion.JCellMolMed20
(5):962-72,2016.PubMed:26945908 KhalilS,etal.ACost-EffectiveMethodtoAssembleBiomimetic3DCellCulturePlatforms.PLoSOne11(12):e0167116,2016.PubMed:27935982 ZhouC,etal.INO80isRequiredforOsteogenicDifferentiationofHumanMesenchymalStemCells.SciRep6:35924,2016.PubMed:27804957 ChenK,etal,HumanMSCspromotescolorectalcancerepithelial-mesenchymaltransitionandprogressionviaCCL5/β-catenin/Slugpathway.CellDeathDis8
(5):e2819,2017.PubMed:28542126 备注：我库冻存时，每支冻存管约含0.5×106细胞量，体积为500μl，预期存活率 70%，建议复苏至1个T25培养瓶中。
中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库 第2页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书 【方案一】：使用ATCC培养液体系
一、骨髓来源人MSC完全培养液配方： ·MesenchymalStemCellBasalMediumforAdipose,UmbilicalandBoneMarrow- derivedMSCs(ATCC®PCS-500-030™) 485ml ·BoneMarrow-MesenchymalStemCellGrowthKit（根据ATCC®PCS-500-030™ 配制） 1kit（配方见下） ES级FBS（Gibco） 35ml rhFGFbasic（R&D233-FB-025） 终浓度125pg/mL rhIGF-1（R&D291-G1-200） 终浓度15ng/mL L-Alanyl-L-Glutamine（SIGMAA8185-5G）终浓度2.4mM 备注：加入BoneMarrow-MesenchymalStemCellGrowthKit后的完全培养液需 保存在2~8℃。
建议在2周内使用。
二、培养Protocol复苏：
1.将骨髓来源人间充质干细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速 融解，取出后拿到超净台内用75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2.将冻存管内细胞悬液转移至含34ml骨髓来源人MSC完全培养液的15ml离心管内，以1000rpm，离心5min。
3.离心后将上清液吸除，另加入新鲜的骨髓来源人MSC完全培养液2ml，吹打悬浮。
4.轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
5.按照骨髓来源人间充质干细胞说明书中建议复苏培养体系转移至一个T25培 养瓶中培养，加入培养液6ml。
6.放入37℃培养箱内培养。
7.复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的骨髓来源人MSC完全培养液， 可以使细胞生长的更好。
传代：备注1：细胞不能太密集，否则容易分化。
1.待细胞长至约80满时进行传代，一般35天，具体视细胞生长情况而定。
2.吸除废液。
3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
第3页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书
4.加入12ml的0.05%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
5.在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要12min）。
6.加2ml骨髓来源人MSC完全培养液终止消化。
7.1000rpm离心5min，去上清，加入骨髓来源人MSC完全培养液2ml。
8.多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
9.按照1213的比例进行传代。
10.放入37℃培养箱内培养。
冻存：
1.按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
2.以1000rpm，离心5min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
3.按每支冻存管内加入500l细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、 冻存日期等基本信息。
4.将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。
冻存液配方：骨髓来源人MSC完全培养液80%，FBS10%，DMSO10% 第4页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书 【方案二】：使用BI公司无血清培养液体系 表
1.用到的主要试剂 品牌 货号 名称 规格保存条 件 BiologicalIndustries 05-200-1ANutriStem®MSCXFBasalMedium 500ml4℃ BiologicalIndustries 05-201-1UNutriStem®MSCXFSupplement 3ml-20℃ Biological05-752-105MSCattachmentsolution100X0.5ml Industries MSC贴壁试剂 4℃ BiologicalIndustries 03-079-1BbinantTrypsin-EDTASolution重组胰酶-EDTA 100ml-20℃ BiologicalIndustries 03-048-1CSoybeanTrypsinInhibitor50X大豆胰酶抑制剂 20ml -20℃ BiologicalIndustries 05-712-1BMSCFreezingSolutionMSC冻存液 100ml4℃ Biological02-023-1Ao’sPBS(w/oCa&Mg)500mlRT Industries (也可用其他品牌不含钙镁的DPBS)
一．实验前准备 1.1完全即用型培养基的准备 冻存的NutriStem®MSCXFSupplement间充质干细胞无血清添加物需要在室 温或2-8℃解冻，避免反复冻融及照光。
完全培养基配制：NutriStem®MSCXFBasalMedium(培养基)：NutriStem® MSCXFSupplement(添加物)：青链双抗=500ml:3ml:5ml，4℃保存，2周 内使用。
(注：双抗非必须)1.2MSC贴壁试剂包被培养皿1）使用无菌的DPBS溶液(货号:02-023-
1，不含Ca2+andMg2+)，将MSC贴壁试剂稀释100倍(1:100)，用移液管轻轻搅拌混合。
2)用稀释过的MSC贴壁试剂涂层培养皿。
3)使用合适的量以涂层培养孔或板，使用量参照表
2。
4)轻轻摇动培养皿，用封口膜包裹涂层的培养皿，然后在2-8℃孵育过夜；或者在CO2培养箱(37℃,至少孵育30分钟)。
5)接种前，用DPBS轻轻冲洗培养皿。
培养器皿 96孔板24孔板12孔板6孔板/3.5cm培养皿 表
2.涂层过程中贴壁试剂建议使用量 表面积cm2/孔或瓶 稀释100倍后的MSC贴 壁试剂使用体积 0.34 0.05-0.1ml 1.9 0.2-0.4ml 3.9 0.4-0.8ml 9.6 1-2ml 第
5页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书 T25瓶/60cm培养皿 25 2.5-5ml T75瓶 75 7.5-15ml 注：涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存，需在一周内使用。
(标 示红色为原厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用。
)
二．
培养方法 2.1MSC复苏 1)按上述1.2步骤包被T-25培养瓶或者6cm培养皿。
2)将储存在液氮中的冷冻管取出（干冰只供运输途中使用，收到冷冻细胞后应 尽快置液氮保存），在37℃水浴中轻轻摇晃冻存管，注意冻存管的盖子和密 封圈不要没入水中，以免污染细胞。
3)待冻存管内容物基本上融化，将冻存管管身上的水吸干，并喷洒75%酒精。
4)将以下步骤所需物品放入超净台保证无菌操作。
在圆锥底15ml离心管内加 入5ml完全培养基。
5)将冻存管盖子打开，细胞悬液全部转移到上述离心管内，轻轻混匀几次。
6)1200rpm，离心3-5min。
7)吸掉上清液。
加入温育好的完全培养液（T-255ml,6cm培养皿4ml）轻轻混 匀细胞，转移到包被好的培养器皿中。
2.2MSC传代培养 1)待细胞饱和度达到约60~70%后进行传代(细胞不能太密集，否则容易分化)， 吸弃需传代板孔中的培养基，每孔加适量DPBS轻轻冲洗1次。
2)根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA(货号：03-079-1)，37℃,5%CO2培养 箱作用2~3min，用吸管吹打培养皿底部，镜下观察细胞完全脱落后。
3)根据重组胰酶-EDTA使用量加入10倍的大豆胰酶抑制剂(货号：03-048-
1，用DPBS稀释50倍)，1200rpm离心3~5min。
4)谨慎吸出上清，细胞团块用3ml~10ml完全培养基悬浮后，混匀细胞悬液。
5)按照1:3~1:4的比例进行传代或按照30000~60000/ml的细胞密度将细胞接种至T25或T75培养瓶或其它培养器皿中传代培养,放入37℃,5%CO2培养箱内培养。
6)每2天更换一次培养基，培养2~4天，待细胞融合度达到80%左右时，参照操作步骤1~3收获细胞。
7)细胞冻存：将细胞团块悬浮于适量(0.5~1×106cell/ml)MSC冻存液(货号05-712-1)中，装入冻存管，2~8℃冰箱放置30min，-80℃冰箱放置24h，转入液氮罐冻存。
第6页，共6页
据报道，该细胞CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD14、CD31、CD34、CD45表达阴性。
物种：人组织：骨生物安全等级：BSL-1细胞来源：2013年引进完全培养液配方：见下方备注【方案一】、【方案二】，我库目前使用【方案二】。
冻存日期/代数：详见冻存管/培养瓶标识。
（建议使用P10前细胞进行实验，若传代次数过多，MSC增殖能力将减弱）参考传代周期：34天参考传代比例：1213参考换液频率：见下方备注【方案一】、【方案二】。
冻存液配方：见下方备注【方案一】、【方案二】。
我库目前使用【方案二】。
细胞形态：纺锤形，成纤维样，贴壁生长支原体检测结果：阴性 骨髓来源人MSC细胞照片： 第1页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书 参考文献： AlMadhounA,etal.ChemicallyDefinedConditionsMediateanEfficientInductionofMesodermalLineagefromHumanUmbilicalCord-andBoneMarrow-MesenchymalStemCellsandDentalPulpPluripotent-LikeStemCells.CellReprogram20
(1):9-16,2018.PubMed:29412734 ZhengB,etal.QuantitativeicParticleImagingMonitorstheTransplantation,Biodistribution,andClearanceofStemCellsInVivo.Theranostics6
(3):291-301,2016.PubMed:26909106 WangM,etal.Coldatmosphericplasma(CAP)surfacenanomodified3Dprintedpolylacticacid(PLA)scaffoldsforboneregeneration.ActaBiomater46:256-265,2016.PubMed:27667017 LiuCJ,etal.SuppressionofIL-8-Srcsignallingaxisby17β-estradiolinhibitshumanmesenchymalstemcells-mediatedgastriccancerinvasion.JCellMolMed20
(5):962-72,2016.PubMed:26945908 KhalilS,etal.ACost-EffectiveMethodtoAssembleBiomimetic3DCellCulturePlatforms.PLoSOne11(12):e0167116,2016.PubMed:27935982 ZhouC,etal.INO80isRequiredforOsteogenicDifferentiationofHumanMesenchymalStemCells.SciRep6:35924,2016.PubMed:27804957 ChenK,etal,HumanMSCspromotescolorectalcancerepithelial-mesenchymaltransitionandprogressionviaCCL5/β-catenin/Slugpathway.CellDeathDis8
(5):e2819,2017.PubMed:28542126 备注：我库冻存时，每支冻存管约含0.5×106细胞量，体积为500μl，预期存活率 70%，建议复苏至1个T25培养瓶中。
中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库 第2页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书 【方案一】：使用ATCC培养液体系
一、骨髓来源人MSC完全培养液配方： ·MesenchymalStemCellBasalMediumforAdipose,UmbilicalandBoneMarrow- derivedMSCs(ATCC®PCS-500-030™) 485ml ·BoneMarrow-MesenchymalStemCellGrowthKit（根据ATCC®PCS-500-030™ 配制） 1kit（配方见下） ES级FBS（Gibco） 35ml rhFGFbasic（R&D233-FB-025） 终浓度125pg/mL rhIGF-1（R&D291-G1-200） 终浓度15ng/mL L-Alanyl-L-Glutamine（SIGMAA8185-5G）终浓度2.4mM 备注：加入BoneMarrow-MesenchymalStemCellGrowthKit后的完全培养液需 保存在2~8℃。
建议在2周内使用。
二、培养Protocol复苏：
1.将骨髓来源人间充质干细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速 融解，取出后拿到超净台内用75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2.将冻存管内细胞悬液转移至含34ml骨髓来源人MSC完全培养液的15ml离心管内，以1000rpm，离心5min。
3.离心后将上清液吸除，另加入新鲜的骨髓来源人MSC完全培养液2ml，吹打悬浮。
4.轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
5.按照骨髓来源人间充质干细胞说明书中建议复苏培养体系转移至一个T25培 养瓶中培养，加入培养液6ml。
6.放入37℃培养箱内培养。
7.复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的骨髓来源人MSC完全培养液， 可以使细胞生长的更好。
传代：备注1：细胞不能太密集，否则容易分化。
1.待细胞长至约80满时进行传代，一般35天，具体视细胞生长情况而定。
2.吸除废液。
3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
第3页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书
4.加入12ml的0.05%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
5.在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要12min）。
6.加2ml骨髓来源人MSC完全培养液终止消化。
7.1000rpm离心5min，去上清，加入骨髓来源人MSC完全培养液2ml。
8.多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
9.按照1213的比例进行传代。
10.放入37℃培养箱内培养。
冻存：
1.按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
2.以1000rpm，离心5min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
3.按每支冻存管内加入500l细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、 冻存日期等基本信息。
4.将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。
冻存液配方：骨髓来源人MSC完全培养液80%，FBS10%，DMSO10% 第4页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书 【方案二】：使用BI公司无血清培养液体系 表
1.用到的主要试剂 品牌 货号 名称 规格保存条 件 BiologicalIndustries 05-200-1ANutriStem®MSCXFBasalMedium 500ml4℃ BiologicalIndustries 05-201-1UNutriStem®MSCXFSupplement 3ml-20℃ Biological05-752-105MSCattachmentsolution100X0.5ml Industries MSC贴壁试剂 4℃ BiologicalIndustries 03-079-1BbinantTrypsin-EDTASolution重组胰酶-EDTA 100ml-20℃ BiologicalIndustries 03-048-1CSoybeanTrypsinInhibitor50X大豆胰酶抑制剂 20ml -20℃ BiologicalIndustries 05-712-1BMSCFreezingSolutionMSC冻存液 100ml4℃ Biological02-023-1Ao’sPBS(w/oCa&Mg)500mlRT Industries (也可用其他品牌不含钙镁的DPBS)
一．实验前准备 1.1完全即用型培养基的准备 冻存的NutriStem®MSCXFSupplement间充质干细胞无血清添加物需要在室 温或2-8℃解冻，避免反复冻融及照光。
完全培养基配制：NutriStem®MSCXFBasalMedium(培养基)：NutriStem® MSCXFSupplement(添加物)：青链双抗=500ml:3ml:5ml，4℃保存，2周 内使用。
(注：双抗非必须)1.2MSC贴壁试剂包被培养皿1）使用无菌的DPBS溶液(货号:02-023-
1，不含Ca2+andMg2+)，将MSC贴壁试剂稀释100倍(1:100)，用移液管轻轻搅拌混合。
2)用稀释过的MSC贴壁试剂涂层培养皿。
3)使用合适的量以涂层培养孔或板，使用量参照表
2。
4)轻轻摇动培养皿，用封口膜包裹涂层的培养皿，然后在2-8℃孵育过夜；或者在CO2培养箱(37℃,至少孵育30分钟)。
5)接种前，用DPBS轻轻冲洗培养皿。
培养器皿 96孔板24孔板12孔板6孔板/3.5cm培养皿 表
2.涂层过程中贴壁试剂建议使用量 表面积cm2/孔或瓶 稀释100倍后的MSC贴 壁试剂使用体积 0.34 0.05-0.1ml 1.9 0.2-0.4ml 3.9 0.4-0.8ml 9.6 1-2ml 第
5页，共6页 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库细胞说明书 T25瓶/60cm培养皿 25 2.5-5ml T75瓶 75 7.5-15ml 注：涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存，需在一周内使用。
(标 示红色为原厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用。
)
二．
培养方法 2.1MSC复苏 1)按上述1.2步骤包被T-25培养瓶或者6cm培养皿。
2)将储存在液氮中的冷冻管取出（干冰只供运输途中使用，收到冷冻细胞后应 尽快置液氮保存），在37℃水浴中轻轻摇晃冻存管，注意冻存管的盖子和密 封圈不要没入水中，以免污染细胞。
3)待冻存管内容物基本上融化，将冻存管管身上的水吸干，并喷洒75%酒精。
4)将以下步骤所需物品放入超净台保证无菌操作。
在圆锥底15ml离心管内加 入5ml完全培养基。
5)将冻存管盖子打开，细胞悬液全部转移到上述离心管内，轻轻混匀几次。
6)1200rpm，离心3-5min。
7)吸掉上清液。
加入温育好的完全培养液（T-255ml,6cm培养皿4ml）轻轻混 匀细胞，转移到包被好的培养器皿中。
2.2MSC传代培养 1)待细胞饱和度达到约60~70%后进行传代(细胞不能太密集，否则容易分化)， 吸弃需传代板孔中的培养基，每孔加适量DPBS轻轻冲洗1次。
2)根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA(货号：03-079-1)，37℃,5%CO2培养 箱作用2~3min，用吸管吹打培养皿底部，镜下观察细胞完全脱落后。
3)根据重组胰酶-EDTA使用量加入10倍的大豆胰酶抑制剂(货号：03-048-
1，用DPBS稀释50倍)，1200rpm离心3~5min。
4)谨慎吸出上清，细胞团块用3ml~10ml完全培养基悬浮后，混匀细胞悬液。
5)按照1:3~1:4的比例进行传代或按照30000~60000/ml的细胞密度将细胞接种至T25或T75培养瓶或其它培养器皿中传代培养,放入37℃,5%CO2培养箱内培养。
6)每2天更换一次培养基，培养2~4天，待细胞融合度达到80%左右时，参照操作步骤1~3收获细胞。
7)细胞冻存：将细胞团块悬浮于适量(0.5~1×106cell/ml)MSC冻存液(货号05-712-1)中，装入冻存管，2~8℃冰箱放置30min，-80℃冰箱放置24h，转入液氮罐冻存。
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